抗氯霉素單鏈抗體基因工程菌表達條件優化

四川理工學院 邊名鴻 左 勇 陳欲云

氯霉素（CAP）是一種高效廣譜的抗生素，在各種動物傳染性疾病的防治方面得到了廣泛的應用。但是其具有嚴重的毒副作用，長期微量攝入氯霉素不僅會使大腸桿菌、沙門氏菌等多種菌株產生耐藥性，而且會引起動物機體正常菌群失調，抵抗力降低，易感染各種疾病（袁耀輝等，2008）。氯霉素在食用動物中的殘留，可通過食物鏈在人體中富集，能引起人類的再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥等疾病，因此，氯霉素在動物性食品中的殘留對人類的健康構成了潛在危害。歐盟、美國等發達國家相繼禁止或嚴格限制使用氯霉素。我國農業部也已禁止使用該藥（滑靜等，2003）。但由于氯霉素抑菌效果好，價格低廉，常被違法使用。因此，探索靈敏、高效、快速的氯霉素殘留檢測方法具有現實意義。

酶聯免疫測定法（ELISA）作為一種食品中殘留藥物的檢測技術，因其較好的敏感性和特異性，廣泛應用于氯霉素殘留檢測上，國外已將此方法的試劑盒商品化。目前我國用于氯霉素殘留檢測的ELISA試劑主要來源于進口，價格比較昂貴，國內雖有一些采取雜交瘤技術生產抗氯霉素單克隆抗體的方法，但普遍存在著生產規模小、質量不穩定、生產成本高和難于放大生產等問題。基因工程單鏈抗體分子質量小，制備方法簡單，能夠通過基因改造來增強其親和力和特異性，特別是易于放大生產 （沈倍奮等，2005），將其應用于ELISA檢測中，則可以解決目前ELISA應用中的眾多問題。本論文研究了基因重組單鏈抗體高效表達的影響因素，為下一步的研究和生產提供條件。

1 試劑與方法

1.1 實驗儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器 SW-CJ-IF型凈化工作臺 （蘇州安泰空氣技術有限公司）；THZ-051型高精度數 控 搖 床 （SHENRGY BIOCOZOR公 司 ）；D-37520型臺式冷凍高速離心機 （Thermo公司）；垂直板電泳槽、恒流電泳儀、凝膠掃描分析系統（上海天能有限公司）。

1.1.2 實驗菌株和培養基 抗CAP單鏈抗體工程菌BL21菌株，本實驗室保存。

LB培養基：0.5%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1% 氯化鈉。

1.1.3 試劑 Tris、HCl、IPTG、SDS、 丙烯酰胺、EDTA、β-巰基乙醇、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、溴酚藍、甘氨酸、NaCl、NaAc 等均購自廣州威佳科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線的繪制 取保存菌種，以1%的接種量接種在2 mL的試管培養基中，37℃，200 r/min活化過夜。第2天以1%的接種量接種在100 mL的三角瓶培養基中，37℃，200 r/min進行培養， 分別在 0、1、2、3、4、5、6、7 h 取 1 mL 培養液，用可見光分光光度計測OD600。以時間為橫坐標、OD600為縱坐標，繪制工程菌的生長曲線。

1.2.2 誘導物的優化 取保存菌種，以1%的接種量接種在2 mL的試管培養基中，37℃，200 r/min活化過夜。第2天以1%的接種量接種在100 mL的三角瓶培養基中，37℃，200 r/min培養3 h后，分別加入IPTG、乳糖、別乳糖進行誘導，4 h后停止培養。各取100 μL菌液，5000 r/min離心5 min，棄上清。分別加入100 μL 2×上樣緩沖液，100℃沸水浴煮沸5 min，12000 r/min離心5 min，取上清進行垂直板電泳。

1.2.3 誘導時機的優化 取保存菌種，以1%的接種量接種在2 mL的試管培養基中，37℃，200 r/min活化過夜。第2天以1%的接種量接種在100 mL的三角瓶培養基中，37℃，200 r/min分別培養至1.5、3、4.5 h時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），均誘導培養4 h后停止。各取100 μL菌液，處理方法與1.2.2中相同，進行SDS-PAGE檢測。

1.2.4 誘導時間的優化 取保存菌種，以1%的接種量接種在2 mL的試管培養基中，37℃，200 r/min活化過夜。第2天以1%的接種量接種在100 mL的三角瓶培養基中，37℃，200 r/min培養至3 h加入IPTG誘導表達。從誘導0 h開始，分別在誘導 1、2、3、4、5 h 取樣， 每次取 100 μL 菌液，處理方法與1.2.2中相同，進行SDS-PAGE檢測。

2 結果與分析

2.1 工程菌的生長曲線 在100 mL的三角瓶培養基中，工程菌在37℃，200 r/min的條件下生長，其OD600隨時間變化如表1。

表1 工程菌生長的OD600變化

以時間為橫坐標，OD600為縱坐標繪制的生長曲線如圖1。

圖1 工程菌生長曲線

由圖1可以看出，工程菌的生長規律在1.5 h進入對數生長早期，3 h進入對數生長中期，4.5 h進入對數生長末期，6 h開始進入穩定期了。

2.2 誘導物的優化 對于構建的抗CAP單鏈抗體基因工程菌BL21，使用三種誘導物進行誘導表達后，與空白宿主菌比較，在分子質量大約為28 kD處均有一新增條帶，如圖2所示。此大小與抗CAP單鏈抗體的理論大小相一致，判斷為單鏈抗體目的蛋白。從圖2中可以看出，在其他條件相同的情況下，三種誘導劑的誘導效果不同，使用IPTG作誘導劑，外源蛋白的表達量最高，掃描顯示高達45%，其他兩種誘導物的表達量分別為25%和35%，相比較IPTG的效果較好。

2.3 誘導時機的優化 基因工程菌生長和外源蛋白的表達是一種矛盾，外源蛋白的表達會影響工程菌自身的生長，所以選擇合適的誘導時機對獲得高的產量具有重要的意義。結合表2和圖3中可以看出，培養3 h進行誘導，外源蛋白的表達量掃描顯示達43%，菌體的生物量OD600值為4.010；培養1.5 h進行誘導，外源蛋白的表達量掃描顯示高達52%，菌體的生物量OD600值為3.212；培養4.5 h進行誘導，菌體的OD600值為4.450，外源蛋白的表達量掃描顯示只有33%。外源蛋白的總產量既與外源蛋白表達的百分比有關，也與工程菌的生物量有關，需從相乘的角度綜合考慮，因此選擇培養3 h后進行誘導表達較優。

圖2 不同誘導物對蛋白表達的影響

表2 不同誘導時機下菌體的OD600

圖3 不同誘導時機對蛋白表達的影響

2.4 誘導時間的優化 外源蛋白在宿主菌中的積累會隨著時間而發生變化。一般會隨著時間的進行，從零開始逐漸增多，直至達到一峰值，有些工程菌會維持峰值不變，有些會隨著時間的進行，由于菌體內蛋白酶的作用，外源蛋白的表達量會轉而降低。因此篩選出合適的誘導時間對獲得高產、控制發酵進程有重要意義。 本試驗中，抗CAP單鏈抗體基因工程菌誘導3 h的蛋白表達量為 35%，誘導4 h為 45%，誘導5 h為 40%，如圖4。因此把誘導時間定為4 h是一個較好的選擇。

圖4 不同誘導時間對蛋白表達的影響

3 討論與小結

基因工程產品的表達優化對于工業生產有著重要的意義。通過表達優化，可以為發酵生產提供良好的工藝條件，降低成本，提高經濟效益，提高產品的競爭力（顧娟等，2010）。外源蛋白表達的影響因素較多，有培養基、培養溫度、誘導物的種類、誘導物的濃度、誘導時機、誘導時間等，其中誘導物的種類、誘導時機、誘導時間是較為重要的三個影響因素（邊六交等，2006）。本實驗就此三個主要因素，對抗氯霉素單鏈抗體的高效表達進行了研究。實驗中發現，三個因素均對表達有較大影響，最終選取IPTG作為誘導物、接種后培養3 h進入對數生長中期開始誘導、誘導4 h結束作為高效表達的優化工藝。

[1]邊六交，楊曉燕，樊鈺虎，等.重組鼠源角質細胞生長因子的發酵表達優化及純化[J].中國醫藥工業雜志，2006，37（5）：314 ～ 317.

[2]顧娟，勞勛，金明飛，等.人胰高血糖素樣肽-1突變體融合蛋白在大腸桿菌中的自誘導表達優化[J].微生物學通報，2010，37（5）：726 ～ 731.

[3]滑靜，于同泉，孫英健，等.動物牲食品中氯霉素殘留檢測的研究進展[J].動物科學與動物醫學報，2003，20（12）：36 ～ 37：.

[4]沈倍奮，陳志南，劉民培.重組抗體[M].北京：科學出版社，2005.21～37.

[5]袁耀輝，李鋒，柴春彥，等.動物性食品中氯霉素殘留檢測技術進展[J].上海畜牧獸醫通訊，2008，6：5 ～ 7.