黑龍江省黑河市周邊地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗

文 / 朱少奇 喬 潔 黑龍江省黑河市畜牧獸醫(yī)局

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化學(xué)、微生物等因素的刺激所發(fā)生的一種炎癥變化，是一種多因素疾病綜合征。

奶牛乳房炎是目前危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一，每年可造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。雖然有多種病原微生物可引起奶牛乳房炎，但國內(nèi)外公認的最常見、最主要的病原為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌等腸桿菌[2]。長期以來，牛場獸醫(yī)對奶牛乳房炎的治療以抗生素治療為主，但常規(guī)抗生素治療的結(jié)果并不理想。為進一步了解奶牛乳房炎病原菌的發(fā)展變化趨勢以及設(shè)計具有針對性的治療方案，本文對黑龍江省黑河市璦琿區(qū)4 個規(guī)模化牛場的奶樣進行了微生物學(xué)調(diào)查和藥敏試驗，以期為乳房炎的防治提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶樣

以黑龍江省黑河市璦琿區(qū)四嘉子鄉(xiāng)、河南屯鄉(xiāng)以及幸福鄉(xiāng)的4 個奶牛養(yǎng)殖小區(qū)作為試驗基地，選取隱性乳房炎（BMT陽性）或臨床型乳房炎患牛發(fā)病乳區(qū)100 個，于采取治療措施之前，對發(fā)病乳區(qū)乳頭嚴格消毒，采集奶樣（2 mL/乳區(qū)）至無菌管內(nèi)。

1.1.2 培養(yǎng)基

犢牛血清、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂、7%羊血瓊脂、麥康凱瓊脂、MH 瓊脂、氧化酶、馬尿酸鈉、山梨醇、七葉苷、生化管（成套）、微量發(fā)酵管，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 標準菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923 （β溶血）、大腸桿菌ATCC25922，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 藥敏紙片

青霉素G、頭孢噻肟、先鋒V、先鋒VI、阿米卡星、卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、氨芐青霉素、鏈霉素，均購自哈爾濱生物制藥一廠。

1.1.5 診斷試劑

隱性乳房炎診斷液（簡稱LMT），購自蘭州中獸醫(yī)研究所。

生1：我把幾何圖形分為兩類，一類是立體的，比如：長方體、正方體、圓柱、圓錐、球、棱柱、棱錐等；一類是平面的，比如：正方形、長方形、圓、三角形等．

1.2 試驗方法

1.2.1 奶樣采集

選取隱性乳房炎陽性（經(jīng)BMT對所選奶牛進行隱性乳房炎檢測）乳區(qū)或臨床型乳房炎乳區(qū)100 個。用75%酒精溶液消毒乳頭孔處后，傾斜帶無菌棉拭子的試管，將管口對準乳頭孔，采集乳汁3～5 mL。采樣過程嚴格無菌操作。

1.2.2 微生物分離培養(yǎng)

分別將無菌采集的隱性乳房炎或臨床型乳房炎乳樣搖勻，吸1 mL加入到10 mL含5%犢牛血清的營養(yǎng)肉湯中，同時用接種環(huán)無菌取樣涂布于羊血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。將平板上的單個典型菌落（如未見菌落生長則用肉湯培養(yǎng)物接種到羊血瓊脂平板，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h）分別接種到鑒別培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h 。觀察菌落形態(tài)、生長特征，經(jīng)革蘭氏染色后進行鏡檢，并通過觸酶、氧化酶試驗進行純檢，初步判定細菌種類。

1.2.3 細菌生化鑒定

根據(jù)初步鑒定結(jié)果，對分離到的菌株有選擇地進行生化試驗。中等大小G-桿菌，接種于三糖鐵培養(yǎng)基，再用腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ—15e 進行生化鑒定；G+葡萄球菌按葡萄球菌屬細菌生化編碼鑒定管TH—16s進行生化鑒定；G+鏈球菌進行CAMP試驗及鏈球菌生化鑒定，包括馬尿酸鈉水解試驗，甘露醇、山梨醇和七葉苷發(fā)酵試驗等。

1.2.4 藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片擴散法，將經(jīng)過鑒定的菌株各隨機選擇4 株，接種于營養(yǎng)肉湯純培養(yǎng)液，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h ，滴加1 mL培養(yǎng)液于血瓊脂平板表面，用“L”形涂布棒均勻涂布。待平板表面稍干燥后，用無菌鑷子夾取抗菌藥物紙片，按一定距離分別貼于平板上，置37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h 后取出，用游標卡尺測量各藥的抑菌環(huán)直徑。計算同一類菌不同菌株的平均抑菌直徑。直徑小于16 mm為不敏感，16～20 mm為中度敏感，大于20 mm為高度敏感。供試驗藥物為青霉素G、頭孢噻肟、先鋒V、先鋒VI、阿米卡星、卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、氨芐青霉素和鏈霉素。

表1 100 個奶牛乳房炎陽性奶樣細菌鑒定結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 細菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)觀察

在營養(yǎng)瓊脂平板、血平板、高鹽甘露醇瓊脂平板上生長良好，菌落形態(tài)為圓形、濕潤、突起、光滑、邊緣規(guī)則的淡黃色小菌落；在血平板上見明顯溶血；在麥康凱瓊脂平板上不生長；在肉湯中渾濁、沉淀，并在管壁形成菌環(huán)；革蘭氏染色為G+，呈葡萄串狀、成雙或單個排列的球菌，可初步判斷為金黃色葡萄球菌。

在營養(yǎng)瓊脂生長不良，在羊血平板上生長良好，可見圓形、灰白色、突起、光滑、較濕潤小菌落，多呈β型溶血；觸酶試驗陰性，CAMP 試驗陽性；革蘭氏染色為鏈狀、短鏈狀或成雙排列的G+圓型或卵圓型球菌，可初步判斷為鏈球菌。

在營養(yǎng)瓊脂平板上生長良好，形成圓形、乳白色、突起、光滑、較濕潤中等大小菌落，麥康凱瓊脂平板上呈紅色；革蘭氏染色為G-桿菌，可初步判斷為大腸桿菌。

2.2 細菌生化鑒定

根據(jù)觸酶試驗、凝固酶試驗陽性，參考《葡萄球菌屬細菌生化鑒定編碼冊（TH-16s）》（杭州市天和微生物試劑有限公司）中規(guī)定的生化培養(yǎng)鑒定指標進行鑒定。觸酶試驗、凝固酶試驗陽性，能分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，發(fā)酵甘露醇，硝酸鹽、V-P陽性，溶血明顯，可判斷為葡萄球菌。

發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，不發(fā)酵山梨醇、棉籽塘；水解馬尿酸鈉、水楊苷、膽汁，不水解明膠、七葉苷；CAMP、吲哚試驗陽性，V-P試驗、甲基紅、觸酶試驗陰性，可判斷為無乳鏈球菌。

根據(jù)CAMP 試驗結(jié)果，以及水解七葉苷（非發(fā)酵）和馬尿酸鹽的能力區(qū)分無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌。無乳鏈球菌不水解七葉苷（非發(fā)酵），水解馬尿酸鹽，CAMP 試驗陽性；停乳鏈球菌不水解七葉苷（非發(fā)酵）和馬尿酸鹽CAMP試驗陰性，非β型溶血；乳房鏈球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物呈均勻渾濁，能水解七葉苷（非發(fā)酵）和馬尿酸鹽，CAMP 試驗陰性。

當鏡檢為G-桿菌，觸酶試驗陽性，氧化酶陰性時，接種麥康凱瓊脂平皿、三糖鐵瓊脂斜面陽性后，根據(jù)《腸桿菌科細菌生化編碼鑒定冊（GYZ-15e）》（杭州市天和微生物試劑有限公司）中規(guī)定的生化培養(yǎng)鑒定指標進行鑒定，即在麥康凱瓊脂平皿菌落為粉紅色、V-P陰性、不分解尿素、構(gòu)椽酸鹽陰性、MR 和吲哚陽性，三糖鐵產(chǎn)酸產(chǎn)氣即可判斷為大腸桿菌。

2.3 細菌分離鑒定結(jié)果

對100 個陽性乳樣進行細菌分離培養(yǎng)和鑒定，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，在75 份血清中檢出10 種共89 個菌株，檢出率為75%（75/100），其中葡萄球菌33 株，占37.1%；鏈球菌33 株，占37.1%；大腸桿菌9 株，占10.1%。從表1中可以看出，葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌是采樣牧場引起乳房炎的主要致病菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

對分離出的主要病原菌進行藥敏試驗，結(jié)果見表2。表2表明：病原菌基本上對青霉素G、鏈霉素產(chǎn)生耐藥性；金葡菌對阿奇霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、先鋒V、氯霉素高度敏感；表皮葡萄球菌對頭孢噻肟、卡那霉素、阿米卡星高度敏感；無乳鏈球菌對氯霉素、四環(huán)素、阿米卡星高度敏感；停乳鏈霉菌對氨芐青霉素、卡那霉素、先鋒VI、頭孢噻肟高度敏感。乳房鏈霉菌和大腸桿菌只對環(huán)丙沙星和先鋒V敏感。病原菌對本試驗其余藥物中度敏感。

3 討論

從奶牛乳房炎病原菌分離鑒定結(jié)果可以看出，采樣牧場引起奶牛乳房炎的主要病原菌是葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌。這與黑河周邊地區(qū)奶牛養(yǎng)殖現(xiàn)狀密切相關(guān)。飼料營養(yǎng)失衡、管理不善、欄舍潮濕、養(yǎng)殖小區(qū)衛(wèi)生條件差、擠奶設(shè)備維護保養(yǎng)不及時或消毒不徹底都會引起乳房炎發(fā)生。因而，實際生產(chǎn)中應(yīng)切實加強牛群飼養(yǎng)管理與擠奶設(shè)備的維護。

藥敏試驗結(jié)果顯示，不同來源的分離菌株對頭孢噻肟、先鋒V、先鋒VI、阿米卡星、卡那霉素、氯霉素高敏；但對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、氨芐青霉素已出現(xiàn)耐藥趨勢；青霉素G、鏈霉素對所有菌株已幾乎無效。以上結(jié)果，一方面表明了當前本地奶牛乳房炎的治療首選藥物主要有以上6 種；另一方面，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株的數(shù)量愈來愈多[3]。在防治奶牛乳房炎時，臨床用藥要注意按規(guī)定的劑量與療程使用，及時更換不同的敏感藥物進行治療，以免產(chǎn)生過多的耐藥現(xiàn)象，不利于今后的治療，而且還會影響人類用藥及身體健康。■

表2 藥敏試驗結(jié)果

[1]卜仕金. 奶牛乳房炎的抗菌藥物防治. 獸藥與飼料添加劑，1999，4（3）：14-16.

[2]袁永隆，張禮華，劉春傳，等. 我國奶牛乳房炎常見病原菌的區(qū)系調(diào)查. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992，25（4）：70-76.

[3]孔雪旺，陳功義. 奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗. 中國奶牛，2007（1）：43-44.