廣東省西江與東江草魚群體遺傳多樣性的RAPD分析

黎卓鍵，劉 麗

華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642

草魚（Ctenopharyngodon idellus）俗稱草鯇，英文名為Grass carp，系屬脊椎動物門（Vertebrata）、硬骨魚綱（Osteichthys）、鯉 形 目（Cypriniformes）、 鯉 科（Cyprinidae）、 雅 羅 魚 亞 科（Leuciscinae）、草魚屬（Ctenopharyngodon Steindachner，1866）[1]。草魚作為四大家魚之首，其所形成的產(chǎn)業(yè)對廣東省淡水漁業(yè)乃至全國的淡水漁業(yè)的發(fā)展都起到了極其重要作用。

隨 機 擴 增 多 態(tài) DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是建立在PCR技術基礎上檢測DNA序列多態(tài)性和建立分子遺傳標記的技術，Williams等[2]和Welsh等[3]運用隨機引物擴增尋找多態(tài)DNA片段作為分子標記。如今RAPD技術在生物的遺傳多樣性、群體遺傳學、分類學及農(nóng)牧業(yè)的遺傳育種等研究中得到廣泛應用[4]。本研究旨在用RAPD技術對廣東草魚進行群體的親緣關系探討，以期為了解廣東省草魚資源現(xiàn)狀提供相關的遺傳背景資料和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2008年5 月～2008年7月于西江肇慶江段、東江新豐江水庫和佛山龍江鎮(zhèn)錦記魚苗場共取90尾草魚個體的背部肌肉放在凍存管置于液氮罐，運回實驗室液氮保存。采集點分布見圖1，采集信息見表1。

圖1 樣品采集地點

表1 草魚采樣信息

1.2 DNA提取

取液氮保存肌肉組織大約10mg，與200μl細胞裂解液混勻，加入1.5μl蛋白酶K[5]，置于55℃水浴鍋中消化過夜。從水浴鍋中取出，加入300μl三氯甲烷混勻，上下?lián)u動10min～15 min。10 000×g離心2min，取約200μl上清液，置于1.5 ml心管中。在離心管中加入250μl沉淀液，混勻，室溫放置2 min，10 000×g離心2min。倒掉上清液，立即加入50μl 2M NaCl，輕輕振蕩直至DNA樣品完全溶解，加入1.5μl RNase A，然后置于37℃水浴鍋中水浴5min～10min。加入150μl冷乙醇，-20℃放置10min，10 000×g離心4 min，倒掉乙醇，加入300μl 75%乙醇清洗，10 000×g離心2 min，倒掉75%乙醇，自然風干至無酒精味，加入50μl TE，37℃水浴鍋中水浴溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 隨機引物及篩選

從已研究草魚的RAPD文獻中選取60條引物，以高純度的草魚基因組DNA為模板，對60個引物進行篩選，從中選取擴增條帶多且清晰的7個隨機引物進行PCR擴增。

表2 7個引物的名稱和序列

1.4 RAPD-PCR“標準”反應體系

擴增條件為: 94℃預變性5min，94℃變性1min，36℃退火1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上，用恒壓80V電泳1小時，溴化乙錠染色，紫外透射儀下觀察并照相。根據(jù) 50bp DNA ladder（takara）對擴增的片段進行確認。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 RAPD片段的觀察與統(tǒng)計

根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳帶型，進行群體內(nèi)和群體間的比較。統(tǒng)計時僅記錄清晰、穩(wěn)定的電泳帶。在同一個引物相同的遷移率上，不同個體間出現(xiàn)的帶記為1，未出現(xiàn)的帶記為0，在excel表中按格式輸入每一個引物的0、1距陣。

1.5.2 多態(tài)位點比例

利用擴增片段原始數(shù)據(jù)的0-1矩陣，使用RAPD data analyzer 1.3v數(shù)據(jù)分析軟件，計算群體內(nèi)個體間的多態(tài)位點數(shù)和總位點數(shù)，然后根據(jù)如下公式計算多態(tài)位點比例：多態(tài)位點比例（P）=多態(tài)位點數(shù)/總位點數(shù)×100%

1.5.3 遺傳相似度和遺傳距離

根據(jù)統(tǒng)計的原0-1矩陣，進行個體間與群體間的比較分析。按公式Sxy=2nxy/（nx+ny）計算出個體間遺傳相似性指數(shù)（nxy是個體x和y的共有帶數(shù)，nx和ny分別是個體x和y擴增的擴增帶數(shù)）。

群體間的相似性指數(shù)（Sij）為種群i中的個體和種j中的個體隨機組合所得的相似指數(shù)和平均值[6-7]。用公式D=1-S計算個體間及種間的遺傳距離。最后用MEGA2. 1軟件的類平均聚類法（unweighed pair-groupmethod of analysis， UPGMA） 和 鄰 接 法（neighbor joining， NJ）對0-1矩陣值進行聚類分析。

1.5.4 Shannon遺傳多樣性指數(shù)

種群內(nèi)的遺傳分化可用Shannon遺傳多樣性指數(shù)進行估算，指數(shù)越大遺傳多樣性越大，種群分化的程度越高。每個RAPD多態(tài)位點上，可擴增出的帶出現(xiàn)頻率是p（出現(xiàn)次數(shù)/個體總數(shù)），不能擴增出的帶頻率是q，其中p+q=1。根據(jù)RAPD各多態(tài)位點的基因型頻率，應用下列公式計算Shannon遺傳多樣性指數(shù)指數(shù) H，從而估算種群內(nèi)的遺傳距離。用公式：H =-∑ pi Ln pi進行計算，即每個RAPD多態(tài)位點上帶出現(xiàn)的頻率p，取Ln為自然對數(shù)。∑是每個多態(tài)位點的值求和[8]。

2 結果

2.1 模板DNA的檢測

圖2 草魚群體基因組DNA瓊脂糖凝膠（0.7%）電泳圖

本實驗提取得到的DNA，經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳顯示DNA帶型致密，分子量較大，約在20kb左右，符合RAPD對模板DNA質量的要求。圖2顯示的是草魚群體基因組DNA瓊脂糖凝膠（0.7%）電泳圖

2.2 RAPD擴增結果

在選用的60個隨機引物中，有53個引物無擴增產(chǎn)物或因結果不穩(wěn)定無法做進一步分析。其余7個隨機引物在3個群體的90個個體中擴增結果穩(wěn)定、重復性佳，共在西江草魚群體中檢測到62個位點、在東江草魚群體中檢測到59個位點、在良種場草魚群體中檢測到56個位點，檢測到的平均位點數(shù)分別為西江8.86，東江8.43，良種場8個，得出3個草魚群體的多態(tài)位點比例分別為21.00%，18.64%，33.96%。其多態(tài)位點比例的大小順序為：良種場草魚〉西江草魚〉東江草魚。

表3 RAPD擴增的位點數(shù)、多態(tài)位點數(shù)以及多態(tài)位點比例

引物5在西江草魚群體的RAPD擴增物瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳圖

注：1.50bp分子量標準；2～16.引物5在西江草魚群體的擴增條帶箭頭所示西江和東江草魚群體中檢測到而良種場草魚群體中沒有檢測到的特異譜帶（約200bp處）

引物5在東江草魚群體的RAPD擴增物瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳圖

注：1.50bp分子量標準；2～15.引物5在東江草魚群體的擴增條帶箭頭所示西江和東江草魚群體中檢測到而良種場草魚群體中沒有檢測到的特異譜帶（約200bp處）

引物5在良種場草魚群體的RAPD擴增物瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳圖

注：1. 50bp分子量標準；2～14. 引物5在良種場草魚群體的擴增條帶良種場草魚群體中在約200bp處沒有檢測到相應的特異譜帶

圖3 引物5在3種魚群體基因組的RAPD-PCR擴增圖譜

2.3 3個草魚群體的群體內(nèi)遺傳相似度和遺傳距離

運用NTSYS-pc 2.2軟件計算3個草魚群體內(nèi)的遺傳相似度和遺傳距離，結果見表4。由表4中可以看出遺傳相似系數(shù)在0.8863～0.9811，平均值為0.9435。這3個草魚群體內(nèi)的遺傳距離大小順序恰恰相反，其大小順序為良種場草魚群體〉西江草魚群體〉東江草魚群體

表4 三個草魚群體內(nèi)的遺傳相似度和遺傳距離

2.4 Shannon遺傳多樣性指數(shù)

用Shannon遺傳多樣性指數(shù)計算了3個草魚群體的群體內(nèi)遺傳多樣性，其結果見表5。由于不同的隨機引物檢測到的位點數(shù)及多態(tài)性位點數(shù)均有所不同，按各個引物計算的遺傳多樣性指數(shù)值就有一定的差異，因此計算各個引物的Shannon遺傳多樣性指數(shù)后求出其平均值。

表5 三個草魚群體的群體內(nèi)的Shannon遺傳多樣性指數(shù)

Shannon遺傳多樣性指數(shù)越大表明遺傳多樣性越大，種群分化的程度越高。數(shù)據(jù)結果表明：良種場的草魚群體遺傳多樣性〉西江草魚群體遺傳多樣性〉東江草魚群體遺傳多樣性。其結果和表4計算所得3個草魚群體內(nèi)的遺傳距離的結果是相吻合的。

2.5 3個草魚群體間的遺傳相似度和遺傳距離

通過對RAPD譜帶的比較和分析，分別計算出草魚3個群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離，結果見表6。

表6 草魚三個群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離

如表6所示，群體間遺傳相似性指數(shù)西江和東江之間最大，為0.9454；東江和良種場次之，為0.8821；西江和良種場之間最低，為0.8532。群體間的遺傳距離良種場和西江之間最大，為0.1468；良種場和東江之間次之，為0.1179；西江和東江之間最小，為0.0546。草魚群體間的平均遺傳距為0.1064，并根據(jù)表的遺傳距離，構建聚類圖（圖4）。西江、東江草魚群體先聚為一類，然后再與良種場草魚群體相聚。

圖4 3個草魚群體遺傳距離聚類圖

3 討論

聚類分析可以對物種的親緣疏遠關系進行比較，量化種群間的差異程度。形態(tài)距離的聚類分析結果表明，西江和東江之間的距離最近，形態(tài)也很相近，良種場群體和西江、東江這兩個群體之間在形態(tài)上有一定差異。魚類形態(tài)特征很大程度上取決于遺傳特性。而魚類形態(tài)學性狀也與魚類生活成長環(huán)境條件相緊密聯(lián)系的。形態(tài)性狀的穩(wěn)定與演化，都是魚類對特定棲息環(huán)境條件的長期適應，在生活習性、形態(tài)結構和生理機能等方面發(fā)生相適應的變化。形態(tài)性狀是與生理機能、生活習性的變化相一致的。綜合分析結果表明：在形態(tài)方面，3個草魚群體內(nèi)差異不大，而東江和西江草魚群體間差異不大，這兩個地方群體與良種場群體間有一定差異，這同它們來源差異是相符合的，也可能與遺傳背景有關。要從形態(tài)上對不同地方草魚進行區(qū)分不能要求只用少數(shù)指標就能鑒別，而要用多項參數(shù)綜合判別。本實驗對3個草魚群體在分子水平進行種質鑒定研究是為了盡最大可能研究不同地方草魚遺傳變異的水平；研究草魚物種的進化潛力；生物資源的永續(xù)利用，為草魚資源的生產(chǎn)利用提供依據(jù)。

由于新豐江水庫是90世紀60年代蘇聯(lián)援建，因此建庫已超過50年。結果導致新豐江水庫的野生草魚屬于一個比較密閉的群體，它和西江野生的草魚群體在形態(tài)分析上的相似性比較大，而這兩個地方的草魚與良種場的草魚在形態(tài)上有一定的差異。這與所采良種場的草魚是來自長江水系的是相吻合的。因為在珠江水系基本上沒有草魚產(chǎn)卵場，草魚的產(chǎn)卵場基本在長江中游[9]。

魚類物種是以種群的形式而存在的，不是個體的隨意綜合，而是分別結合成或大或小的種群，種群之間并不是以連續(xù)的方式存在，組成一個統(tǒng)一的繁殖群體。在逐漸形成一個穩(wěn)定群體的過程中，魚類種群由于突變后的自然選擇而出現(xiàn)變異和進化。魚類種群的遺傳變異水平是衡量魚類資源狀況和遺傳背景的一個重要標準。通過研究掌握現(xiàn)有魚類資源的遺傳多樣性，對不同生物群體進行鑒別，從而可以清楚地掌握種群的分布；可以知道各個群體之間的親緣關系。遺傳多樣性的降低將導致其適應能力降低，有害隱性基因增加及經(jīng)濟性狀衰退，會產(chǎn)生嚴重的遺傳瓶頸效應，最后導致物種退化。因此，檢測種群的遺傳變異和多樣性水平是十分必要的。迄今為止，已有多種不同的檢測手段檢測遺傳變異水平，RAPD分子標記技術由于其操作簡便，產(chǎn)生的多態(tài)性豐富等優(yōu)點，可以直接檢測基因組中的變異情況，為種群和種群內(nèi)個體之間的遺傳多樣性研究提供有力的手段

目前己有不少學者應用RAPD技術對草魚進行了遺傳多樣性分析[10-11]。薛國雄等[10]對長江、珠江、黑龍江三江水系的草魚種群進行RAPD分析結果表明:每一水系的草魚種群均有其特征性基因圖譜，可作為種群鑒定的依據(jù)。章懷云[12]等對草魚和紅鯉進行了RAPD分析，結果表明草魚的遺傳多樣性明顯低于紅鯉。目前在草魚的多樣性研究中，不同方法得到的研究結果均顯示草魚的遺傳多樣性不豐富[11-13]。張四明[11]采用RAPD技術對長江中游的湖北嘉魚與江西瑞昌兩個地理群體和中游的漢江和湘江兩大水系的鰱魚和草魚的群體進行了遺傳學研究。發(fā)現(xiàn)草魚遺傳多樣性從大到小的分布是瑞昌、漢江、湘江、嘉魚，四個地理群體草魚的遺傳分化度較低，可能與地理位置較近和基因交流頻繁有關；草魚有可能在歷史上經(jīng)歷了“遺傳瓶頸”效應，推測草魚很有可能是一個遺傳多樣性貧乏的常見物種[14]。

本實驗中，利用7個引物對珠江水系西江和東江草魚群體進行RAPD分析，并以良種場草魚群體作為對照，得到的結果為：草魚群體間的遺傳距離西江和良種場之間最大，為0.1468；東江和良種場之間次之，為0.1179；西江和東江之間最小，為0.0546。3個草魚群體內(nèi)的遺傳差異很小，草魚的遺傳多樣性很低，和已有的研究結果相符。今后研究過程中，應采用不同方法（形態(tài)學、細胞遺傳學、生物化學、分子生物學等技術），從不同層次上（群體、個體、細胞、分子水平）進行研究，并且進行綜合分析，使人們對所研究的對象有一個更加全面準確的認識，以便更好的利用草魚魚類資源。

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