TopoIIα在胃癌組織中的表達與臨床意義

李曉燕 高天慧 李林蔚 劉明月

胃癌是我國最常見腫瘤之一，目前據Parkin報道其發生率位居第四位，死亡率僅次于肺癌占第二位［1］。手術是主要的治療措施，但由于早期診斷率低，大多數患者失去手術機會，胃癌的復發與轉移是胃癌治療失敗的主要原因之一［2］，因此化療在胃癌治療中處于非常重要的地位。有試驗研究表明:TopoIIα在胃癌組織中的高表達與胃癌的發生發展以及多種抗腫瘤藥物作用機制有關，并且與多藥耐藥有關。本研究應用免疫組織化學方法，檢測了胃癌中TopoIIα的表達，旨在探討其與胃癌的臨床病理特征的關系，指導胃癌化療及耐藥。

1 資料與方法

1.1 標本 收集河南省人民醫院病理科2008年10月至2010年10月間89例胃腺癌手術切除石蠟標本，取20例癌旁正常胃組織作為對照組，原發性胃癌的組織學分類標準參照2000年WHO胃癌組織學，均為胃腺癌，根椐2003年國際抗癌聯盟(UICC)和2010美國腫瘤聯合會(AJCC)聯合制定的TNM分期標準進行臨床分期。

1.2 儀器與試劑 BP121S型分析天平、病理石蠟切片機、電熱恒溫培養箱、低溫冰箱、醫用燒烤微波爐、自動染片機、自動脫水機、微量吸管、光學顯微鏡、鏡下圖像以Olympus Dp70圖像采集分析儀進行采集、分析。

TopoIIα(產品編號:MAB-0588)，試劑盒選用即用型MaxVision檢測試劑盒，對二甲氨基偶氮苯(DAB)顯色劑，均購自福州邁新生物技術開發公司。酒精、二甲苯、蘇木素等試劑由河南省人民醫院病理科提供。

1.3 試驗方法 ①常規石蠟標本切片:使用切片機將本研究中所有石蠟包埋標本進行切片，所有切片厚度為3～5 μm;②標本脫蠟至水:脫蠟前標本置于60℃恒溫箱20 min。在二甲苯及梯度乙醇中脫蠟水化(二甲苯10 min×2次，無水酒精5 min×2次、90%酒精5 min×1次、75%酒精5 min×1次);③TopoIIα采用檸檬酸高溫修復，37℃水浴箱內孵育30 min;④PBS液沖洗3 min;⑤阻斷內源性過氧化物酶活性:H2O2100 ml+CH3OH 900 ml液避光室溫浸泡10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，然后蒸餾水沖洗2 min×1次，PBS沖洗2 min×3次;⑥PBS沖洗3次滴加TopoIIα 40～50 μl，4℃冰箱過夜;⑦冰箱內取出標本，PBS沖洗2次，滴加即用型MaxVision檢測試劑40～50 μl，室溫下40 min;⑧DAB顯色:每張切片加兩滴新鮮配制的DAB，在顯微鏡下控制顯色(5～15 min);⑨自來水沖洗;蘇木素復染30 s，鹽酸酒精分化;自來水沖洗;⑩脫水、透明:95%乙醇5 min×1次;70%乙醇5 min×1次;無水酒精5 min×2次;二甲苯10 min×2次;○11封片:切片干燥后，用中性樹膠封固，干燥后顯微鏡下觀察。

1.4 結果判斷 每批實驗均設陽性和陰性對照，TopoIIα表達陽性可見細胞核有棕黃色顆粒樣沉淀，陰性細胞核無棕黃色顆粒樣沉淀。染色分級整張切片無陽性細胞(-)，陽性細胞數＜10%(+)，陽性細胞數10% ～50%(++)，陽性細胞數≥50%(+++)。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件包進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TopoIIα在胃癌中的表達。見圖1，表1。TopoIIα在胃腺癌中的表達為53.9%(48/89)。在正常胃組織中的表達為0%。

圖1 TopoIIα在胃癌中的表達

表1 TopoIIα表達與胃癌臨床病理參數之間的關系(例，%)

2.2 TopoIIα表達與胃癌臨床病理特征間的關系，表1。TopoIIα表達與患者性別、年齡、腫瘤大小無顯著性相關，而與腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期相關，且在胃賁門處表達高于胃底部，隨著分化程度的增加、淋巴結轉移的增多及腫瘤分期的增加其TopoIIα的表達增強。

3 討論

DNA拓撲異構酶(Topo)普遍存在于各類生物種群中，包括病毒、原生動物、真菌、植物、昆蟲、兩棲類、鳥類及哺乳動物的正常和腫瘤細胞中，參與細胞有絲分裂過程中的DNA轉錄、重組、復制及染色體分離［3-4］，是調節核酸空間結構動態變化，控制核酸生理功能的關鍵酶。DNAToPoll主要在細胞核內發揮生理作用。TopoII又稱回旋酶，最早發現于1980年，是與細菌DNA回旋酶(gyrase)具有同源性的二聚體蛋白。人類的 TopoⅡ有兩種同工酶，為 TopoIIα和 TopoIlβ。TopoIIα由17號染色體編碼，TopoIlβ則由3號染色體編碼，兩者均可與DNA形成穩定的共價復合物。TopoIlα大多位于增殖細胞中，而且在快速增殖細胞中的水平是靜止細胞中的數倍，在細胞內主要分布于細胞核漿，并多呈網狀結構聚集在染色體著絲粒周圍［5］。TopoIlα參與 DNA的轉錄、翻譯、復制及染色體的分離等過程，主要存在于S2、G2/M期，有兩種功能:一作為細胞的增殖指數，表達于S2、G2/M期;二作為抗癌藥物的靶點指數。同時研究發現在腫瘤組織中，TopoIIα的表達增高是一個普遍現象，而且臨床方面已逐漸將TopoIIα作為判斷細胞或腫瘤增殖程度的一個標志［6-8］;并且，許多研究發現 TopoIIα 表達與患者的預后有關［9，10］。亦有研究表明，TopoIlα陽性表達與腋窩淋巴結轉移和腫瘤遠處轉移有關［11］。Varis［12］和 Wikman［13］分別發現，在胃癌和肺癌中TopoIlα的增殖比Her-2更常見。

本研究中TopoIIα的陽性表達率為53.9%，與胃癌的部位有關，胃賁門癌TopoIIα的陽性表達率較高;與胃癌組織的分化程度、淋巴結轉移及胃癌分期相關，低分化者表達顯著高于高中分化，胃癌分期越晚其表達越高，提示組織分化越差，分期越晚，說明其惡性程度高，細胞增殖活躍，存在于S2、G2/M期的TopoIIα量多，陽性率就高，同時也提示耐藥性越低，對化療藥物敏感性高。

TopoII為靶點的抗癌藥較多，根據作用方式不同分為嵌入型和非嵌入型兩類。嵌入型抑制劑系通過其分子中類似嘌呤堿或嘧啶堿的多環結構嵌到TopoⅡ與DNA結合部位的雙鏈之間，從而干擾了該酶將DNA斷端重新接合的正常功能，并進一步造成DNA鏈斷裂損傷，導致細胞死亡這一類藥物有蔥環類抗生素如阿霉素，柔紅霉素，放線菌素，米托蒽醌，安吖啶，咔唑類等［14］。非嵌人型抑制劑其作用模式還不十分楚，可能是直接作用TopoⅡ或是僅僅與雙鏈DNA中的一條鏈結合以影響酶功能。這一類藥物依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(teniposide)等。一般認為TopoII陽性表達越高，化療藥物具備的靶點越多，對抗癌藥物敏感性越高。

TopoⅡ抑制劑引起的由ToPon介導的MDR不典型多藥耐藥(at-MDR)。主要表現在以下幾方面:①TopoIIα基因的位點突變或缺失;②TopoIIα的磷酸化水平提高，已經證實，TopoIIα的高磷酸化與它的催化活性及易解離復合物形成呈負相關;③TopoIIα基因調控異常導致TopoIIα蛋白水平降低。臨床上對腫瘤細胞的治療中如不了解基因TopoIIα水平，盲目使用抗腫瘤藥，易導致腫瘤細胞抗藥性的產生，影響療效。

4 小結

胃癌的發生和發展是多因素、多階段的綜合結果，本研究發現TopoIIα與胃癌的部位、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期等因素有關。而DNA拓撲酶抑制劑開辟了腫瘤治療的新途徑，其具體療效還需要進一步的臨床試驗研究。TopoⅡ抑制劑引起的由TopoII介導的不典型多藥耐藥(at-MDR)在胃癌的研究中有待于進一步的試驗研究。

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