短穗魚尾葵灰斑病菌的鑒定及生物學特性*

陳 劍, 紀燁斌, 張 能, 謝昌平

(海南大學環(huán)境與植物保護學院,儋州 571737)

短穗魚尾葵灰斑病菌的鑒定及生物學特性*

陳 劍, 紀燁斌, 張 能, 謝昌平**

(海南大學環(huán)境與植物保護學院,儋州 571737)

[目的]明確引起短穗魚尾葵灰斑病的病原菌及該菌的生物學特性。[方法]從短穗魚尾葵感病組織上分離、純化病菌,經(jīng)致病性測定后根據(jù)其形態(tài)特征進行種類鑒定,并測定其在不同培養(yǎng)條件下的生物學特性。[結(jié)果]引起短穗魚尾葵灰斑病的病原菌為小孢擬盤多毛孢菌[Pestalotiopsis microspora(Speg.)Satista&Peresapud Batista]。該菌在PSA培養(yǎng)基上長勢最好;菌絲生長和孢子萌發(fā)的最適溫度為25℃;完全光照條件最利于菌絲的生長和產(chǎn)孢;在pH5時菌絲生長最好,pH6時孢子萌發(fā)率最高,pH2時孢子不萌發(fā);孢子的致死溫度為50℃。[結(jié)論]上述結(jié)果可以為短穗魚尾葵灰斑病的防治提供依據(jù)。

短穗魚尾葵; 擬盤多毛孢菌; 生物學特性

*致 謝: 在試驗過程中,廣西大學韋繼光老師和河南科技大學劉愛榮老師對病原鑒定給予了幫助,謹表示衷心的感謝!

**通信作者 Tel:0898-23306865;E-mail:xiechangping002@sina.com

短穗魚尾葵(Caryota mitisLoureiro)別名叢立孔雀椰子,為叢生常綠小喬木,樹形優(yōu)美,葉色濃綠[1],在公共綠化,庭園栽培,室內(nèi)擺設等方面都有廣泛的應用,是一種重要的園林景觀樹種。近年來隨著城市綠化、家庭觀賞和插花的應用,短穗魚尾葵的栽培逐漸增加。而由擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsisspp.)真菌引起的短穗魚尾葵灰斑病發(fā)生也日益嚴重,發(fā)病時葉片上病斑累累,葉片變黃干枯,嚴重時枝條回枯,甚至整株枯萎。嚴重影響了短穗魚尾葵的觀賞價值。對棕櫚科植物擬盤多毛孢菌引起的病害已有報道和描述,但未對短穗魚尾葵灰斑病進行詳細報道[2-6]。為此作者對該病的病原菌進行了鑒定和生物學特性研究,為采取有效的防治措施提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料來源

發(fā)病材料來自海南大學儋州校區(qū)校園內(nèi)的短穗魚尾葵。

1.2 病原菌分離與純化

采用常規(guī)組織分離方法[7],從感病葉片和葉柄上分離病原菌。并將從葉片和葉柄上分離所得的病原菌分別標記為C1和C2菌株。采用瓊脂平板稀釋純化法進行純化,再將純化的C1和C2菌株分別轉(zhuǎn)入試管斜面保存以供測定。

1.3 病原菌致病性測定

將C1和C2菌株的菌絲塊分別接種于健康無病的葉片和葉柄上,采用刺傷和無傷兩種接種方法,接種后保濕。以接種滅菌的瓊脂塊作為對照,逐日觀察并記錄其發(fā)病情況。

1.4 病原菌形態(tài)觀察

將純化的第2代菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基上,在全光照(光照強度為3 000 lx),25℃條件下,培養(yǎng)5 d后,觀察菌落顏色、形狀、大小和產(chǎn)孢情況以及在顯微鏡下觀察分生孢子的顏色、形態(tài)和大小。

1.5 病原菌生物學特性的測定

1.5.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

用滅菌的打孔器(直徑4.5 mm)取菌落邊緣的菌絲塊,分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基(PCA)、Czapek培養(yǎng)基、Richards培養(yǎng)基等5種培養(yǎng)基平板中央,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。每個處理重復3次,培養(yǎng)5 d后,觀察菌絲生長狀況(菌落直徑和形態(tài))及產(chǎn)孢情況(下同)。

1.5.2 溫度對菌絲生長的影響

將菌絲塊接種在PDA培養(yǎng)基平板中央,分別置于5、10、15、20、25、30 ℃和35 ℃的培養(yǎng)箱中進行恒溫光照培養(yǎng)。

1.5.3 孢子致死溫度的測定

該菌培養(yǎng)后在菌落表面產(chǎn)生分生孢子盤,從菌落表面產(chǎn)生的孢子堆中挑取孢子,放入5 mL蒸餾水,配制成孢子懸浮液;在低倍鏡(10×10)下檢查孢子數(shù),用蒸餾水調(diào)節(jié)懸浮液,直至每視野的孢子數(shù)為30～35個。在直徑為1 cm的試管中預先放入2 mL的蒸餾水,分別在恒溫水浴鍋中預熱至40、45℃和50℃(試管內(nèi)的溫度用溫度計測量),然后滴加數(shù)滴預先配制好的孢子懸浮液,處理10 min;取出,用接種環(huán)取孢子懸浮液均勻地涂于涂上PDA培養(yǎng)基的載玻片上,保濕,放置在25℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng),6 h后,用 1 g/L的HgCl2固定,檢查孢子萌發(fā)情況。孢子萌發(fā)以芽管長度超過孢子直徑長度(指直徑小的一邊)的一半為標準(下同)[7]。

1.5.4 光照對菌絲生長的影響

將菌絲塊接種在PDA平板中央,分別置于完全光照、黑暗和光照各12 h、完全黑暗3種光照環(huán)境中,在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.5 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

制作培養(yǎng)液(PDA培養(yǎng)基不加瓊脂),分別調(diào)節(jié)pH 到 2、3、4、5、6、7、8、9,加入卡拉膠,滅菌,重新測定調(diào)節(jié)pH;測定不同pH對菌絲生長的影響時,取菌落邊緣的菌絲塊(PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d),接種在不同pH的PDA培養(yǎng)基平板中央,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。

測定不同pH對孢子萌發(fā)的影響時,將不同pH的PDA培養(yǎng)基均勻地涂在載玻片上,用蒸餾水配制孢子懸浮液,均勻涂在培養(yǎng)基上,保濕,在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6 h后,用1 g/L的HgCl2固定,觀察并記錄孢子萌發(fā)數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 癥狀特點

該病主要危害短穗魚尾葵的葉片和葉柄。葉片上病斑多發(fā)生在葉尖和葉緣,發(fā)病初期在葉片上出現(xiàn)水漬狀褪綠色的小點,病斑逐漸擴展成淺褐色橢圓形或不規(guī)則形小斑,病斑大小為1～3 mm,病斑周圍有黃色的暈圈或無;隨病斑的進一步擴大,多個病斑愈合成不規(guī)則形的大斑,病斑中央呈灰白色,邊緣顏色呈深褐色,在病斑中央散生許多小黑點,發(fā)病嚴重時整葉干枯。葉柄的癥狀與葉片相似,但是無黃色的暈圈,病斑不凹陷,嚴重時枝條回枯,甚至整株枯萎(圖1a,b)。

2.2 病原菌的致病性

接種保濕4 d后刺傷葉片發(fā)病,無傷葉片和對照不發(fā)病。并且C1和C2菌株接種于葉片和葉柄上發(fā)病癥狀均與大田癥狀相同。說明C1和C2是短穗魚尾葵灰斑病的致病菌,且C1和C2均能分別引起葉片和葉柄發(fā)病。同時,也說明該病原菌僅能通過傷口侵入。

2.3 病原菌的形態(tài)

C1和C2菌株均可致病,引起的癥狀相同。C1菌株在PDA培養(yǎng)基上生長迅速,菌落近圓形,邊緣不平滑,菌絲白色絮狀,菌絲層分布均勻,背面淡米黃色,在光照條件下有分布不均勻的青色斑塊,無明顯輪紋。10 d后產(chǎn)生黑色的分生孢子盤,分生孢子長梭形,有的稍微彎曲,4隔5胞,分生孢子大小(18.2～ 28.6)(22.7)μ m ×(5.2 ～ 7.8)(5.9)μ m;中間3個細胞著色,顏色相同,為淡褐色,分隔處顏色加深;色胞長10.4～ 18.2(14.1)μ m;頂胞和尾胞均為三角形,無色透明,頂胞上著生無色附屬絲2～3根,長10.4～26.0(16.2)μ m,尾胞上著生一根基部附屬絲,中生,長3.9～9.1(5.2)μ m。分生孢子芽管從第3個有色胞萌發(fā),首先第3色胞膨大變圓,然后從其一邊或兩邊同時形成凸起的芽管,芽管慢慢伸長變成根狀的細管,隨著芽管的伸長第3色胞逐漸收縮,整個孢子也隨之漸漸收縮,最后芽管長成菌絲,分生孢子也整個萎縮(圖1c,d和e)。通過對C2菌株與C1菌株在培養(yǎng)性狀、分生孢子大小和形態(tài)、有色胞長度、頂端和尾端附屬絲長度以及孢子萌發(fā)等情況進行比對,判斷C1和C2菌株為同一菌株。

圖1 短穗魚尾葵灰斑病癥狀和病原

2.4 病原菌的生物學特性

2.4.1 培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

5種培養(yǎng)基中,PSA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上菌落直徑明顯比其他3種大。PSA和PDA培養(yǎng)基菌落直徑無明顯差異,PCA培養(yǎng)基上最小。病原菌在5種培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d均不能產(chǎn)生分生孢子(表1)。

2.4.2 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

菌絲在 10～30℃范圍內(nèi)均能生長。在10～25℃范圍內(nèi),菌落直徑隨溫度升高而逐漸增大,25℃時菌落直徑最大,在10℃和30℃時菌絲生長極緩慢,5℃和35℃時停止生長;可見該病原菌的生長最適溫度為25℃。孢子在5～35℃范圍內(nèi)均能萌發(fā),在5～25℃范圍內(nèi),孢子萌發(fā)率隨溫度升高而逐漸增大,25℃時孢子萌發(fā)率最大。在25～35℃的范圍內(nèi),孢子萌發(fā)率隨溫度升高而逐漸減小(圖2)。

表1 培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響1)

圖2 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

2.4.3 孢子的致死溫度

40℃水浴處理后,孢子萌發(fā)率為88%;45℃水浴處理后,孢子萌發(fā)率為20%;50℃水浴處理后,孢子不萌發(fā);可見孢子的致死溫度是50℃。

2.4.4 光照對菌絲生長的影響

完全光照條件下,菌落直徑最大,完全黑暗條件下菌落直徑最小,完全光照和完全黑暗下菌絲生長差異明顯;3種光照中只有完全光照能產(chǎn)孢,說明光照對病原菌的菌絲生長和促進產(chǎn)孢有著重要的影響(表2)。比pH為8和9的堿性條件好,由此可以看出偏酸性條件對菌絲生長較有利。pH為3～9時,孢子均能萌發(fā)。pH為6時孢子萌發(fā)率最高為96%,pH為2時不萌發(fā),其他 pH條件下孢子的萌發(fā)率均在80%以上(pH2～6時,孢子萌發(fā)率隨pH的增大而增大;pH為6～9時,孢子萌發(fā)率隨pH的增大而減小)(圖3)。

圖3 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

表2 光照對菌絲生長的影響1)

2.4.5 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

pH為2～9時,菌絲均能生長;pH為5時菌絲生長最好;pH為2～5時,菌落直徑隨pH的增大而逐漸變大;pH為5～9時,菌落直徑隨pH的增大而逐漸變小。pH為3和4的酸性條件菌絲生長要

3 結(jié)論與討論

目前,全世界已報道Pestalotiopsisspp.有241種,對這些種的確定,主要根據(jù)培養(yǎng)性狀、分生孢子的形態(tài)、大小、有色胞的長度和顏色、頂端附屬絲和尾端附屬絲的長度等的差別來確定新種。作者根據(jù)第2代的菌株進行鑒定,并與張家祥報道的危害短穗魚尾葵的3種擬盤多毛孢屬種類烏索拉擬盤多毛孢[P.eusora(Sacc.)J.X.Zhang et T.Xu comb.nov.]、勞格頓擬盤多毛孢[P.laughtonae(DOIdge)J.X.Zhang et T.Xu comb.nov.]、三毛草擬盤多毛孢[P.triseta(M.&Mme.F.Moreau)Stey.][5]進行比對(表3)。其中最為關鍵的特征是3個有色胞的顏色,在這4個種中,僅有P.microspora的3個色胞是同色的,其余3個種均為異色的。同時,P.triseta的分生孢子明顯較P.microspora大,而且頂端附屬絲長度也較長(表3)。

表3 4種擬盤多毛孢的大小和有色胞顏色的比對

通過比對[9-10],確定該病原菌為小孢擬盤多毛孢[P.microspora(Speg.)Satista&Peresapud Batista]。雖然我們所測得的分生孢子大小、頂端附屬絲和尾端附屬絲長度與烏索拉擬盤多毛孢、勞格頓擬盤多毛孢和小孢擬盤多毛孢有一定的差別,這可能是我們的培養(yǎng)代數(shù)不同所致,而每增加一代對分生孢子大小、頂端附屬絲和尾端附屬絲長度的影響情況如何,將有待進一步研究。

通過對病原菌的致病性和生物學特征的研究表明,該病原菌的侵入途徑主要是傷口,菌絲最適的生長溫度是25℃,5℃和35℃時菌絲停止生長,完全光照最有利于菌絲生長和促進產(chǎn)孢;在pH5時菌絲生長最好,這與葛起新等[11]報道是一致的。

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[10]韋繼光,徐同,郭良棟,等.根據(jù)形態(tài)學和分子系統(tǒng)學特征界定擬盤多毛孢屬的種[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學,2005,24(3):311.

[11]葛起新,陳育新,徐同.中國真菌志(第三十八卷:擬盤多毛孢屬)[M].北京:科學出版社,2009:5-7.

Identification of the pathogen of gray leaf spot on Caryota mitis and its biological characteristics

Chen Jian, Ji Yebin, Zhang Neng, Xie Changping
(College of Environmental and Plant Protection,Hainan University,Danzhou571737,China)

[Objective]To identify the pathogen causing the gray leaf spot ofCaryota mitisLoureiro and understand its biological characteristics.[Method]The pathogen was isolated and purified from the infectedC.mitis,and its pathogenicity to the host and its biological characteristics were tested.The pathogen was identified according to its characters.[Result]Gray leaf spot ofC.mitiswas caused byPestalotiopsis microspora(Speg.)Satista&Peresapud Batista.The pathogen growth in the medium PSA was the best;The optimum temperature for hyphal growth and spore germination was 25℃.Full illumination was most conducive to hyphal growth and sporulation.Hyphal growth was the best at pH 5,and spore germination rate was the highest at pH 6,but pH 2 was not inhibitory to germination.The lethal temperature for spores was 50℃.[Conclusion]The results could provide a reference for the control of the gray leaf spot ofC.mitis.

Caryota mitis;Pestalotiopsis microspora; biological characteristics

S 436.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.010

2010-07-09

2010-08-23

海南大學科技基金項目(Rnd0524)