番茄紅素對急性肺損傷大鼠肺毛細血管膜通透性及骨形態生發蛋白-4基因表達的影響

黃澤清，高浩然，楊 舜，侴偉平

（遼寧省腫瘤醫院 麻醉科，遼寧沈陽 110042）

番茄紅素對急性肺損傷大鼠肺毛細血管膜通透性及骨形態生發蛋白-4基因表達的影響

黃澤清，高浩然，楊 舜，侴偉平

（遼寧省腫瘤醫院 麻醉科，遼寧沈陽 110042）

目的：觀察番茄紅素 （Lyc）對急性肺損傷 （ALI）大鼠肺組織毛細血管膜通透性及骨形態生發蛋白-4（BMP-4）mRNA基因表達的影響，探討其對ALI的保護作用。方法：將Wistar大鼠隨機分成3組：對照組（Ⅰ組）、ALI組（Ⅱ組），ALI+Lyc組（Ⅲ組），每組20只，每組中10只處死前注射伊文思藍。從模型制備前1周開始，Ⅰ組和Ⅱ組用橄欖油、Ⅲ組用橄欖油稀釋的番茄紅素樹脂（1g/L）以5ml/kg的劑量灌胃，1次/d。制備酸吸入大鼠ALI模型，測定ALI后6h肺毛細血管通透性、肺濕干質量比、肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性及BMP-4 mRNA的表達。結果：與Ⅰ組比較，Ⅱ組肺組織中伊文思藍提取量顯著增加（P＜0.01），肺濕干質量比值、MPO活性顯著升高（P＜0.05），BMP-4 mRNA表達水平顯著上調（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組肺組織中伊文思藍提取量顯著降低（P＜0.05），肺濕干質量比值、MPO活性明顯均不同程度降低（P＜0.05），BMP-4 mRNA的表達水平顯著下降（P＜0.05）。結論：番茄紅素降低酸吸入致ALI大鼠的肺毛細血管通透性、肺濕干質量比及肺MPO活性，抑制BMP-4 mRNA表達，減輕ALI大鼠早期肺泡毛細血管膜損傷并可能改善后期肺組織的修復，具有肺保護作用。

番茄紅素；急性肺損傷；骨形態生發蛋白

Author’s addressDepartment of Anesthesiology，Liaoning Province Tumor Hospital，Shenyang 110042，China

反流、誤吸所致急性肺損傷 （acute lung injury，ALI）及由此誘發的肺部綜合征一直困擾著臨床醫生，盡管發生率逐步降低，但一旦發生仍然缺乏有效的治療手段，其中氧化損傷和基因表達的改變在病情的發展和轉歸中扮演著重要角色。番茄紅素（lycopene，Lyc）是一種類胡蘿卜素，具有多種生物活性如清除氧自由基、誘導細胞連接和減少淋巴細胞DNA損傷等[1，2]，目前在食品及美容保健方面得到廣泛研究和應用。本研究擬通過觀察番茄紅素預處理大鼠ALI后肺組織毛細血管膜通透性及骨形態生發蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP-4）mRNA 表達的改變，探討其在酸吸入致ALI中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PE9600 PCR儀 （美國 Perkin-elmer公司），EPS-300電泳儀（上海天能公司），HP1100高效液相色譜儀（美國Hewlett Packard公司），721A型分光光度計（重慶儀川）等。番茄紅素樹脂制備參考文獻[3]的兩步溶酶法從新鮮西紅柿中提取，應用HPLC法測定其純度，檢測波長472nm，密封、避光保存，使用時用橄欖油稀釋1g/L，髓過氧化物酶（MPO）（南京建成生物工程研究所）及伊文思藍溶液等。

1.2 分組及模型制備

健康Wistar雄性大鼠60只，體重180～220g，由中國醫科大學動物實驗室提供。隨機分成3組，每組20只，每組中10只處死前注射伊文思藍：對照組（Ⅰ組）、ALI組（Ⅱ組），ALI+Lyc 組（Ⅲ組）。從模型制備前1周開始，Ⅰ組和Ⅱ組用橄欖油、Ⅲ組用橄欖油稀釋的番茄紅素樹脂（1g/L）以5ml/kg的劑量灌胃，每天1次。腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉，暴露氣管，待大鼠呼吸頻率、有創平均動脈壓、心率穩定后進行如下操作：仰位頸前正中氣管穿刺，Ⅰ組經氣管滴入生理鹽水2ml/kg后左右搖動大鼠，Ⅱ組和Ⅲ組用同樣的方法滴入31.6mmol/L鹽酸 （pH 為 1.5）2ml/kg建立 ALI模型，以氧合指數（PaO2/FiO2）≤40kPa作為模型制備成功的標準，清醒后常規飼養。6h后處死，處死前15min每組取10只按20ml/kg經靜脈注入質量濃度為20g/L伊文思藍溶液并標記，處死后剖胸取肺組織。

1.3 肺毛細血管膜通透性測定

取注射伊文思藍并標記大鼠（10只）的一定量肺組織放入4ml/0.5kg/L甲酰胺溶液中浸泡，37℃恒溫水浴 24h，以提取組織中的染料，在620nm處測定光密度值，用單位肺組織中染料提取量（μg/g）來反映毛細血管通透性；肺濕干質量比測定：取一定量未注伊文思藍大鼠（10只）肺組織，用濾紙吸干表面液體，稱濕質量，然后置于80℃烘箱中72h（至質量不再改變），稱干質量，計算肺濕干質量比值。

1.4 肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性測定

應用比色法，按試劑盒說明操作。

1.5 BMP-4 mRNA表達的測定

取未注伊文思藍大鼠（10只）肺組織，總RNA采用Trizol一步法提取，以GAPDH為內參，應用半定量RT-PCR檢測BMP-4 mRNA表達的水平。互補DNA用BcaBEST RNA RCR試劑盒合成。 分別量取 2×Bca 1st緩沖液 10μl、MgSO44μl，dNTP 混合物 1μl，Rnase 抑制劑 0.5μl，BcaBEST多聚酶 1μl，oligo dT 引物 1μl，總 RNA 1μl，不含Rnase的 dH2O 1.5μl，共計每個樣本 20μl。按以下條件進行反轉錄反應：65℃ 1min，30℃ 5min，65℃30min，8℃ 5min，5℃ 5min終止反應。利用如下引物及條件進行PCR反應：GAPDH引物為5'-GAA GGG TGG AGC CA-3'（上游）和5'-TGC CAG CCC CGG CA-3（下游），BMP-4引物為5'-AGC CGA GCC AAC ACT-3'（上游）和5'-CTT CTT CTT GGA CCG-3'（下游）；反應體系包括MgSO46μl，5×Bca 2nd Buffer 16μl，Bca-optimized Taq 0.5μl， 上游引物 1μl， 下游引物 1μl，dH2O 55.5μl， 共計 80μl， 然后將反應液加入到 20μl cDNA 中；PCR 反應條件為：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min循環30次，72℃擴展 5min。取RT-PCR產物10μl用含溴化乙錠的20g/L瓊脂糖凝膠電泳30min（5V/cm），對電泳條帶進行光密度掃描定量，用每組BMP-4和GAPDH校正光密度值之比表示BMP-4 mRNA相對表達水平。

1.6 統計學處理

表1 番茄紅素對大鼠肺毛細血管通透性、肺濕干質量比及MPO的影響（n=10，xˉ±s）

表2 番茄紅素對大鼠肺組織BMP-4 mRNA表達的影響 （n=10， x±s）

2 結果

表1示，與Ⅰ組比較，Ⅱ組肺組織中伊文思藍提取量顯著增加（P＜0.01），肺濕干質量比值、MPO活性顯著升高（均P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組肺組織中伊文思藍提取量顯著降低（P＜0.05），肺濕干質量比值、MPO活性明顯均顯著降低 （均P＜0.05）。表2和圖1示，與Ⅰ組比較，Ⅱ組BMP-4 mRNA的表達水平顯著上調（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組BMP-4 mRNA的表達水平顯著下降（P＜0.05）。

3 討論

胃內容物吸入（誤吸）所致的ALI是臨床誘發成人呼吸窘迫綜合征主要原因之一，死亡率高且缺乏有效的治療手段。目前認為，細胞因子網絡及細胞因子介導的中性粒細胞活化和黏附，并基于白細胞的呼吸爆發和降解作用所產生的髓過氧化物、氧自由基、彈性蛋白酶等損傷肺泡上皮，導致氣體交換功能下降是這一病理過程的基礎[4，5]。我們的研究結果顯示，與對照組相比，ALI組肺組織中伊文思藍提取量顯著增加，肺濕干質量比值、MPO活性顯著升高；而番茄紅素組肺組織中伊文思藍提取量顯著降低，肺濕干質量比值、MPO活性均不同程度降低。番茄紅素是天然單線態氧淬滅劑和氧自由基清除劑，抗氧化能力是β-胡蘿卜素的2倍，維生素E的100倍。說明番茄紅素的應用明顯改善酸吸入致ALI后肺通透性，減輕肺損傷，對肺泡毛細血管膜損傷也具有保護作用。

我們的研究結果顯示，BMP-4 mRNA的表達水平在ALI組顯著上調；而番茄紅素組BMP-4 mRNA的表達水平受到顯著抑制。BMP-4是轉化生長因子（TGF-β）超家族的成員之一，作用廣泛而復雜[6，7]，ALI大鼠支氣管上皮細胞的破壞使上皮-間充質模式單位激活，啟動損傷修復程序，這個過程需要BMP-4、表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、前列腺上皮源性轉錄因子（PDEF）及胰島素樣生長因子（IGF）等的參與，它們之間的平衡決定了修復的結果是接近正常的上皮還是斑痕纖維化。說明番茄紅素通過改變BMP-4 mRNA的表達，具有調節酸吸入致ALI后肺組織修復的作用。

綜上所述，我們把具有抗氧化作用的番茄紅素應用于ALI大鼠，不僅表現出對ALI大鼠早期肺泡毛細血管膜損傷的保護作用，而且可能改善ALI后肺組織的修復。但目前對臨床ALI病例應用抗氧化劑種類、劑量及應用時機的選擇還有待進一步的研究。

[1]WaliszewskiKN，Blasco G.Nutraceuticalpropertiesoflycopene[J].Salud Publica Mex，2010，52（3）：254-265.

[2]Chalabi N，Delort L，Satih S，et al.Immunohistochemical expression of RARalpha，RARbeta，and Cx43 in breast tumor cell lines after treatment with lycopene and correlation with RT-QPCR[J].J Histochem Cytochem，2007，55（9）：877-883.

[3]趙文軍，吳雪萍，高林，等.番茄紅素的簡便提取與貯藏穩定性研究[J].食品科學，2005，26（7）：152-154.

[4]Ravindranath TM，Mong PY，Ananthakrishnan R，et al.Novel role for aldose reductase in mediating acute inflammatory responses in the lung[J].J Immunol，2009，183 （12）：8128-8137.

[5]Vasudevan A，Lodha R，Kabra SK.Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome [J].Indian J Pediatr，2004，71：743-750.

[6]Mehler MF，Mabie PC，Zhang D，et al.Bone morphogenetic proteins in the neverous system [J].Trends Neurosci，1997，20（7）：309-317.

[7]Ducy P，Karsenty G.The family of bone morphogenetic proteins[J].Kidney Int，2000，57：2207-2214.

Effects of lycopene on pulmonary capillary permeability and gene expression of bone morphogeneticprotein-4 after acute lung injury in rats

HUANG Ze-qing，GAO Hao-ran，YANG Shun，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2011 Dec，25（6）：351－353

Objective：To observe the effects of lycopene （Lyc）on pulmonary capillary permeability and gene expression of bone morphogenetic protein-4（BMP-4）mRNA after acute lung injury（ALI）in rats and investigate the protection of lycopene on ALI.Methods：Sixty rats were randomly divided into 3 groups：control group（Ⅰ），ALI group（Ⅱ）and ALI+Lyc group（Ⅲ）.Animal models of ALI induced by HCL inhalation in rats were made to determine the capillary permeability，lung wet/dry weight ratio，myeloperoxidase （MPO）acticity of lung tissue after 6h and the changes of the expression of BMP-4 mRNA in lung tissue.Results：Compared with groupⅠ，in groupⅡ，extraction of Evans blue in lung tissue increased very obviously （P＜0.01），lung wet/dry weight ratio，MPO of lung tissue increased obviously（P＜0.05），the expression of BMP-4 mRNA in lung tissue up-regulated obviously（P＜0.05）.Compared with groupⅡ，in group Ⅲ，extraction of Evans blue，lung wet/dry weight ratio，MPO of lung tissue decreased obviously （P＜0.05），the expression of BMP-4 mRNA in lung tissue downregulated obviously（P＜0.05）.Conclusion：Lycopene show a marked reductive effect on the capillary permeability，lung wet/dry weight ratio，MPO activity of lung tissue and suppress the up-regulation of the expression of BMP-4 mRNA，relieve capillary membrane injuries during prophase and may improve the restoration of lung tissue during anaphase of ALI in rats，has protective effects on lung in ALI rats.

lycopene；acute lung injury；bone morphogenetic protein-4

R364.5

A

1001-0025（2011）06-0351-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2011.06.009

遼寧省博士啟動基金資助項目（20091042）

黃澤清（1973-），男，醫學博士。

2011-08-16

2011-09-05