Box-Behnken中心組合設計法優化達卡巴嗪脂質體制備工藝

程桂茹, 王淑娟, 鄒 巖, 張 龍

(長春工業大學化學工程學院,吉林長春 130012)

0 引 言

達卡巴嗪(DTIC),化學名稱為5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-4-酰胺基咪唑枸櫞酸鹽,是一種新型抗腫瘤藥物,臨床用于惡性黑色素瘤的治療,對肺鱗癌和未分化癌、平滑肌肉瘤、纖維肉瘤等亦有一些治療作用[1-3],但由于達卡巴嗪遇光或熱易變化,在水中不穩定,限制了它的使用。如將DT IC包封在脂質體中,不僅擴大了DTIC的使用范圍,而且提高了療效。脂質體作為藥物載體,可以減小藥物劑量,降低藥物的毒性,減小副作用,具有靶向性[4-5]。文中采用Box-Behnken中心組合設計[6],響應面分析法優化DTIC脂質體制備工藝條件,為更好地應用DTIC提供了理論依據。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

DTIC,長春一心藥業公司;

大豆卵磷脂,天津市光復精細化工研究所;

膽固醇,天津市光復精細化工研究所;

三氯甲烷,天津天泰精細化學品有限公司;

磷酸氫二鈉,天津市福晨化學試劑廠;

磷酸二氫鈉,北京化工廠。

1.2 儀器

UV754N型紫外分光光度計,上海精密科學儀器有限公司;

AL104型電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;

203型旋轉蒸發器,上海豫康科教儀器設備有限公司;

KQ3200型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;

JXA840型透射電子顯微鏡,日本JEOL公司;

THZ-82型汽浴恒溫振蕩器,江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠。

2 方 法

2.1 DTIC含量的測定

2.1.1 紫外最大吸收波長測定

配制0.5 mg/mL的DTIC磷酸鹽緩沖液(pH值 7.4,簡稱 PBS)的標準液,并稀釋至0.02 mg/mL,在紫外光區(UV)與可見光區(VIS)作全波長掃描190～500 nm,確定最大吸收的波長為320 nm。

2.1.2 標準曲線

精密稱取 25 mg DTIC用PBS溶解,并用50 mL容量瓶定容,配成0.5 mg/mL的標準液。用取液器分別量取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2 mL于50 mL容量瓶中,再用磷酸鹽緩沖液定容,其濃度分別為0.0005,0.004,0.008,0.012,0.016,0.020 mg/mL。以磷酸鹽緩沖液為空白,在最大吸收波長下測定吸收值,將藥物濃度與吸光度進行直線回歸,得回歸方程:

2.2 脂質體的制備

采用逆相蒸發法:將適量的磷脂與0.125 g膽固醇溶解在適量的氯仿中,再將0.01 g DTIC溶解在適量 PBS中,將上述溶液于旋干瓶中混合,水浴超聲,減壓蒸發除去有機溶劑,達到膠態后,滴加5 mL磷酸鹽緩沖液,旋轉幫助器壁上的凝膠水化脫落,然后在減壓下繼續蒸發,制得水性混懸液,通過透析除去未包封的藥物,即得到7 mL大單層脂質體。

2.3 脂質體包封率的測定

分別取1 mL DTIC脂質體及空白脂質體裝入透析袋內,置于盛有40 mL PBS的燒杯內,磁力攪拌,透析2 h。取透析液按藥物含量測定中所述的采用紫外分光光度法測定,計算出游離藥物的含量[7-8]。

2.4 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上,選擇對包封率影響較為顯著的3個因素作為考察對象,即大豆卵磷脂與膽固醇質量比(X1),水浴超聲時間(X2),PBS體積(X3),根據單因素試驗結果以及在最高或最低水平時制備DTIC脂質體的可行性,綜合選擇各因素的水平。

因素及水平的設計見表1。

表1 實驗因素水平表

2.5 形態學研究

取少量DTIC脂質體制劑加蒸餾水稀釋,超聲波分散,再滴至專用銅網上,自然揮發,使粒子在銅網上濃縮沉積,用透射電子顯微鏡觀察并照相。

2.6 脂質體的釋藥性曲線

取1 mL DTIC脂質體和空白脂質體裝入透析袋內,置于50 mL磷酸鹽緩沖液中透析,同時取1 mL DTIC脂質體溶液(16 mg/mL)于透析袋中,在50 mL磷酸鹽緩沖液中同時透析以做對比,透析溫度(37±0.5) ℃,于氣浴振蕩器中進行,定時取樣10 mL,同時補加10 mL磷酸鹽緩沖液,采用紫外分光光度計測定不同時間透析液中藥物的含量。

3 結果與討論

3.1 響應面分析

根據 Box-Behnken中心組合設計原理,以X1,X2,X3這3個因素為自變量,以脂質體的包封率為響應值,做3因素3水平的響應面分析設計實驗,所需實驗次數為12次。為了考察實驗誤差的大小,將中心點的實驗重復進行了3次,實驗設計與結果見表2。

利用Minitab軟件對表2數據進行多元回歸擬合,得到DTIC脂質體的包封率對大豆卵磷脂與膽固醇用量比、超聲時間、PBS用量的二次多項回歸模型為:

表2 DTIC脂質體的試驗設計與試驗結果

對該模型進行顯著性檢驗,回歸模型方差分析結果見表3。

表3 DTIC脂質體包封率的回歸模型方差分析

由表3可知,P=0.001＜0.01,表明回歸模型顯著;F=0.97＞0.05,P=0.545＞0.05,不顯著;復相關系數R為0.99795,說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小,可以用此模型來分析和預測DTIC脂質體的制備工藝結果。

回歸模型系數顯著性檢驗結果見表4。

表4 DTIC脂質體包封率回歸模型系數顯著性檢驗結果

由表4回歸模型系數顯著性檢驗結果可知,模型的一次項X1極顯著,X2,X3不顯著;二次項X21,X22,X23極顯著;交互項 X1X2顯著,其它交互項不顯著;表明各影響因素對于DTIC脂質體的包封率的影響不是簡單的線性關系。

表5 回歸分析

表5中的R-Sq的預測和調整數值相差不大,而且接近1。S數值不大,滿足擬合要求。所以,該模型可用于三磷酸胞苷二鈉脂質體制備工藝優化的理論預測。

3.1.1 響應面優化

超聲時間、磷酸鹽緩沖液的用量及其交互作用對達卡巴嗪脂質體包封率影響的曲面和等值線如圖1所示。

由圖1可知,在PBS用量為7.0～8.0 mL,超聲時間在4～5 min的范圍內,包封率不斷增加,之后隨著磷酸鹽緩沖液的用量和超聲時間的延長,包封率有下降的趨勢。

圖1 Y=f(X2,X3)的響應曲面及其等值線

超聲時間、大豆卵磷脂與膽固醇用量比及其交互作用對達卡巴嗪脂質體包封率影響的曲面和等值線如圖2所示。

由圖2可知,大豆卵磷脂與膽固醇用量比對包封率的影響顯著,表現為曲線較陡,當大豆卵磷脂與膽固醇用量比處于5.2左右時,包封率出現極值。

圖2 Y=f(X1,X2)的響應曲面及其等值線

磷酸鹽緩沖液的用量、大豆卵磷脂與膽固醇用量比及其交互作用對達卡巴嗪脂質體包封率影響的曲面和等值線如圖3所示。

圖3 Y=f(X1,X3)的響應曲面及其等值線

由圖3可知,在PBS用量為7.0～8.0 mL和大豆卵磷脂與膽固醇用量比為4～5的范圍內,包封率不斷增加,之后隨著PBS用量和大豆卵磷脂與膽固醇用量的增大,包封率有下降的趨勢。

等值線圖的形狀可反映出交互效應的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反。由圖1～圖3等值線圖可以看出,超聲時間和大豆卵磷脂與膽固醇用量比之間的交互作用顯著,表現為等高線呈橢圓形。相比較而言,PBS用量和超聲時間之間,以及大豆卵磷脂與膽固醇用量比和PBS用量之間的交互作用較小。

比較圖1～圖3可知,大豆卵磷脂與膽固醇用量比對包封率的影響最為顯著,表現為曲線較陡,最佳值在5.2附近;而超聲時間和PBS用量對包封率影響次之,表現為曲線較平滑,且隨著數值增加或減少,響應值變化較小。

為進一步確定最高點,對回歸模型取一階偏導數等于零,得到:

解方程得到:

變換為真實值可得大豆卵磷脂與膽固醇用量比為 5.01,PBS用量為8.04 mL,超聲時間為5.2 min。在此條件下,預測DTIC脂質體的包封率為94.18%。

3.1.2 驗證實驗

在此條件下平行制備脂質體5次,實際測得的平均包封率為94.20%,與理論預測值相比,其相對誤差為0.02%。因此,基于響應曲面法所得的優化制備工藝參數準確可靠。

3.2 脂質體的釋藥性曲線

實驗數據如圖4所示。

由圖4可知,DTIC的脂質體突釋是由未包封的 DTIC從透析膜透過的結果,脂質體在40 min以后平穩釋放藥物。

圖4 達卡巴嗪脂質體的藥物釋放曲線

3.3 DTIC脂質體的形態和粒徑觀察

經逆相蒸發法制備的脂質體為乳白色懸液,電鏡下觀察照片為圓形或類圓形小體,脂質體或分散存在或聚集在一起。達卡巴嗪脂質體是粒徑均勻的球形或近球狀的小囊泡。粒徑測定結果表明,平均粒徑在50 nm左右。電鏡照片如圖5所示。

圖5 DTIC脂質體的透射電鏡照片(放大倍數 ×10 K)

4 結 語

基于實驗設計,通過二次回歸設計得到了DT IC脂質體的包封率與大豆卵磷脂及膽固醇用量比、PBS用量和超聲時間關系的回歸模型,經檢驗證明,該模型是合理可靠的,能夠較好地預測DT IC脂質體的包封率。

利用模型的響應面及其等值線,對影響DT IC脂質體的包封率的關鍵因素及其相互作用進行探討,得到的優化工藝參數為:大豆卵磷脂與膽固醇用量比為5.01,PBS用量為8.02 mL,超聲時間為 5 min。脂質體的包封率為94.18%。實測值為94.20%,僅差0.02%,因此,利用響應面分析的方法對脂質體的制備工藝進行優化,可獲得最優的工藝參數,預測工藝條件與實際工藝條件之間具有較好的擬合度,Box-Behnken中心組合設計可以應用于DT IC脂質體工藝條件的篩選。

[1]劉巍峰,李遠,趙海濤,等.肢體惡性黑色素瘤的外科治療[J].中國骨腫瘤骨病,2010,9(4):294-298.

[2]劉月彩,單保恩,張超.促紅細胞生成素對達卡巴嗪和順鉑抗小鼠黑色素瘤活性的調節作用[J].癌變·畸變·突變,2010(4):298-301.

[3]康愷,李運曼,蔣軼.三種黑素瘤動物模型的建立[J].藥學進展,2006,30(7):326-329.

[4]Colic M,Morse D.Molecular mechanisms of anticancer activityofnatural dietetic products[J].Colloids Surf,1999,154(1/2):167-174.

[5]Le Coutre.Surface planar bilayers of phospholipids used in protein membrance reconstitution:An atomic force microscopy stuty[J].Colloids and Surfaces.B,Biointerfaces,2006,47(1):102-106.

[6]Douglas C,Montgomery.實驗設計與分析[M].北京:中國統計出版社,1998:589-592.

[7]田文瑩,劉洪霞,邱芳萍.響應面法優化微波輔助提取糞鬼傘多糖工藝的研究[J].長春工業大學學報:自然科學版,2009,30(6):629-632.

[8]趙妍,于彬,鄧意輝卜,等.主動載藥法制備硫酸長春新堿脂質體及其包封率的測定[J].中國藥學雜志,2005(10):1559.