鈣蛋白酶相關疾病研究進展*

范麗萍 楊明

(1.廣州體育學院,廣東 廣州 510075;2.樂山市公安局,四川 樂山 614000)

鈣蛋白酶系統主要由鈣蛋白酶(Calpain)和其內源性抑制劑蛋白(Calpastatin,CAST)組成,鈣蛋白酶是體內除了鈣調神經磷酸酶外另一重要的Ca2+依賴性蛋白酶。鈣蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白激酶,不僅參與蛋白質水解,還參與肌肉生長與分化、神經發育、細胞周期調控與凋亡、葡萄糖轉運、細胞信號轉導等正常的生理過程。近年來研究發現鈣蛋白酶還與肌肉萎縮,缺血再灌注損傷、2型糖尿病、風濕性關節炎以及阿爾茨海默病等疾病的發生有關,隨著研究的深入,鈣蛋白酶成為這些疾病靶向用藥的研究熱點。

1 鈣蛋白酶概述

到目前為止,哺乳動物中已發現15種鈣蛋白酶,相關編碼基因共 15個,其中 13個編碼 15種大亞基,2個(Capn4,Capn14)編碼2種小亞基[1]。鈣蛋白酶家族成員互為同工酶,普遍存在于絕大多數動物細胞內,有的分布廣泛,如鈣蛋白酶I(μ-calpain,calpain1)和鈣蛋白酶 II(m—calpain,calpain2);有的則表現出很強的組織特異性,如鈣蛋白酶IIIa(calpain3a)主要分布于骨骼肌,而calpain8a,calpain8b主要分布于胃組織。

鈣蛋白酶由 1個大亞基(80 k D)和 1個小亞基(30 kD)組成異二聚體。大亞基有 4個結構域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ):結構域Ⅰ位于N一末端,與Ca2+后可發生自降解,引起蛋白酶構象改變;結構域Ⅱ是由Cysl05、His262、Asn286 3個氨基酸殘基組成酶的活性中心,這與其它的半胱氨酸激酶類似,如 papain,caspase和cathepsins;結構域Ⅲ是抑制蛋白或激活蛋白結合的部位;結構域Ⅳ是Ca2+結合的部位,包含5個與鈣調素類似的EF-hand模體。小亞基有2個結構域,結構域Ⅰ富含甘氨酸和疏水氨基酸,是酶與細胞膜結合的部位;結構域Ⅱ與大亞基結構域Ⅳ結構相似,也含有Ca2+結合位點[2-3]。

2 鈣蛋白酶的活性調節

鈣蛋白酶的活性依賴于胞漿內Ca2+濃度,不同的鈣蛋白酶同工酶對Ca2+濃度要求不同。u-calpain只需微摩爾濃度的Ca2+就可激活,而m-calpain需毫摩爾級的Ca2+濃度才能被激活,正常情況下,細胞內游離Ca2+濃度在0.1～5μmol·L-1之間,主要激活前者[4]。Ca2+對鈣蛋白酶的激活過程分為兩步,首先是Ca2+與大亞基的結構域Ⅲ,結構域Ⅳ和小亞基的結構域Ⅱ結合,引起大亞基變構。第二步是變構的大亞基的結構域Ⅱ組成酶活性部位水解底物蛋白。

在較高的Ca2+濃度作用下,鈣蛋白酶還可以發生自溶作用,分解為只需低濃度Ca2+濃度維持的有活性亞單位。研究發現[5],正常情況下 u-calpain需要 2-200μM 的Ca2+才能激活,然而一旦激活發生自溶時,全長80 k D的u-calpain降解為76 kD或78 k D的片段,該降解片段僅需0.5-2μM 的Ca2+維持活性。與此類似,骨骼肌特異的P94(Calpain3)也可自降解為56 k D、58 k D或60 kD的片段,同樣只需較低的Ca2+濃度即可維持。因此,鈣蛋白酶的自溶作用對活性起到調節作用,但到目前為止具體機制仍不清楚。

3 鈣蛋白酶相關疾病

鈣蛋白酶系統作為機體細胞內蛋白降解的主要酶系之一,對維持體內蛋白質代謝的平衡起著重要的作用。鈣蛋白酶含量的提高或活性的增強時均可導致蛋白分解大于合成,機體呈現負氮平衡,反之則會導致體內陳舊、毀損的蛋白無法及時更新。上述兩種情況下,均可導致細胞結構變化和功能障礙,另外鈣蛋白酶還是調節細胞生長,代謝過程的信號轉導分子

3.1 鈣蛋白酶與骨骼肌萎縮

骨骼肌萎縮過程與肌原纖維蛋白分解增強密切相關,負責肌原纖維蛋白降解的主要是泛素-蛋白酶體和鈣蛋白酶系統。泛素-蛋白酶體可以降解細胞內80%以上的胞內蛋白,但對于完整的肌原纖維并不起作用。鈣蛋白酶系統系統負責將肌原纖維劈裂成可降解的肌絲片段,而后泛素-蛋白酶體才能降降解這些蛋白[6]。因此,鈣蛋白酶可認為是啟動骨骼肌肌原纖維蛋白降解第一步的主要酶系。研究發現,去神經、費用等原因造成的肌肉萎縮中均發現鈣蛋白酶活性的提高,而過量表達沒有活性的m-calpain或者Calpastatin能使大鼠 L8成肌細胞的蛋白降解速率下降30-63%[7],也有研究表明過量表達全長的Calpastatin可使轉基因小鼠比目魚肌萎縮速度下降30%[8]。

3.2 鈣蛋白酶與缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷時,胞漿的Ca2+濃度明顯增加,進而導致細胞結構損傷和功能代謝障礙,稱為鈣超載。缺血再灌注損傷時鈣超載的機制主要是Na+/Ca2+交換異常和細胞膜和肌漿網膜損傷引起Ca2+內流。Ca2+濃度增加可以激活鈣蛋白酶促進細胞膜和結構蛋白的損傷。因此,缺血再灌注損傷時鈣超載和生物膜損傷相互促進,形成惡性循環。

研究發現[9]心肌缺血再灌注損傷時Calpain1表達增加,并認為Calpain1劈裂激活PKC在缺血再灌注引起心肌梗死中起重要作用,使用鈣蛋白酶抑制劑SNJ-1945可以明顯減少缺血再灌注引起心肌損傷[10]。另外有研究發現在腎臟移植缺血再灌注損傷時也有Calpain的激活,使用鈣蛋白酶抑制劑同樣也起到了很好的預防損傷的作用[11]。

3.3 鈣蛋白酶與阿爾茨海默病

阿爾茨海默病又稱老年癡呆癥。是一種進行性發展的致死性神經退行性疾病,臨床表現為認知和記憶功能不斷惡化,日常生活能力進行性減退,并有各種神經精神癥狀和行為障礙。目前比較認可的兩種發病機制為:其一為由于淀粉樣前蛋白的異常導致蛋白成分漏出細胞膜,導致神經元纖維纏結和細胞死亡;其二為與載脂蛋白E(APO-E4)的基因有關,APO-E4使神經細胞膜的穩定性降低,導致神經元纖維纏結和細胞死亡。

研究發現阿爾茨海默病患者腦神經細胞鈣離子的濃度和鈣蛋白酶的活性均上升[12],鈣蛋白酶通過劈裂分解周期素依賴激酶-5(CDK-5)和細胞內調節激酶(ERK)激活兩者,最終引起細胞凋亡;另有研究發現過量表達鈣蛋白酶內源抑制劑Capastatin(CAST)能減少神經元的凋亡,對神經細胞起到明顯的保護作用[13]。以上說明鈣蛋白酶在阿爾茨海默病的發生發展過程中發揮重要作用。

3.4 鈣蛋白酶與糖尿病

隨著生活水平的提高,糖尿病發病率有上升趨勢,其中2型糖尿病占多數。該型患者機體對胰島素反應差,因此又稱胰島素抵抗性糖尿病。研究發現2型糖尿病患者的Calpain-2的活性亞單位顯著上升[14],這可能是導致胰島B細胞功能紊亂和凋亡的原因。另外糖尿病的發生除了與飲食有關外,遺傳因素也在2型糖尿病的發生中起作用,對于糖尿病的易感基因,研究較多的就是Calpain-10基因。有研究表明Calpain-10基因突變與2型糖尿病患者的發生密切相連[15],Calpain-10編碼的蛋白與葡萄糖的攝取、轉運有關。

3.5 鈣蛋白酶與風濕性關節炎

風濕性關節炎是一種常見的急性或慢性結締組織炎癥,可反復發作并累及心臟。臨床以關節和肌肉游走性酸楚、重著、疼痛為特征,屬變態反應性疾病,是風濕熱的主要表現之一,多以急性發熱及關節疼痛起病。研究發現風濕性關節炎患者鈣蛋白酶活性增強,鈣蛋白酶通過劈裂激活蛋白激酶C(PKC)和炎性介質 IL-1、IL-6、TNF-α等參與風濕性關節炎的發生[16]。而使用鈣蛋白酶抑制劑E-64-d則可明顯抑制實驗大鼠的關節炎[17]。

3.6 其他鈣蛋白酶相關的疾病研究進展

除了上述鈣蛋白酶相關疾病外,在白內障患者的晶狀體中發現Ca2+濃度的提高,鈣蛋白酶被激活,組成晶狀體的細胞骨架蛋白質、肌動蛋白等被降解,導致白內障。另外,研究發現使用鈣蛋白酶抑制劑或敲除calpain-3的小鼠均可以可以阻止白內障的發生[18-19]。此外,在肌營養不良、腫瘤、燒傷等疾病中也發現鈣蛋白酶活性的提高[3]。說明鈣蛋白酶可能在上述疾病過程中也發揮重要作用,具體機制有待于進一步研究。

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