病原性海洋弧菌致病機(jī)理及其快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

夏 凡，楊麗君，王 靜，李兆杰，劉玉敏

（威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東威海264200）

病原性海洋弧菌致病機(jī)理及其快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

夏 凡，楊麗君*，王 靜，李兆杰，劉玉敏

（威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東威海264200）

病原性海洋弧菌是引起我國(guó)特別是沿海地區(qū)細(xì)菌性食物中毒危害的首要食源性致病菌。本文重點(diǎn)綜述了病原性海洋弧菌中能引發(fā)人類重要疾病的副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)理以及目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于其的各種檢測(cè)方法、原理、應(yīng)用及研究進(jìn)展。

病原性，海洋弧菌，快速檢測(cè)，研究進(jìn)展

病原性海洋弧菌是一群在海洋環(huán)境中最常見，廣泛分布于內(nèi)灣、沿岸、外洋水域、沉積物和海洋生物體中，可能感染魚類或人類，可在人群中引起暴發(fā)性食物中毒的一類條件致病菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要限制性因素。早在1970年，Tubiash等［1］就證實(shí)弧菌是長(zhǎng)牡蠣和歐洲扁牡蠣幼體壞死性疾病的病原菌。迄今已被報(bào)道過的海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原弧菌有20多種，其中，副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、鰻弧菌（V.anguillarum）、燦爛弧菌（V.splendidus）等10多種弧菌已被認(rèn)為是魚類的重要致病菌。某些種類也會(huì)導(dǎo)致人或其他動(dòng)物發(fā)病，但以霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌三者最重要，且為人所熟知。國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，1992～2001年的十年間我國(guó)微生物性食物中毒的病原分布發(fā)生了顯著變化，由副溶血弧菌引發(fā)的食物中毒發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，均已超過沙門氏菌食物中毒，躍居首位，特別是在沿海省份，由該菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒總數(shù)的比例高達(dá)60%以上。另外，隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，特別是高密度養(yǎng)殖模式的推廣，養(yǎng)殖生物的細(xì)菌性疾病發(fā)生頻率和范圍也逐漸增大，近幾年，我國(guó)出口的水產(chǎn)品曾發(fā)生過多起因病原性弧菌超標(biāo)引起的退貨、銷毀、取消注冊(cè)代號(hào)事件，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此病原性海洋弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)維持水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展、水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督和保護(hù)公眾健康等方面都具有十分重要的意義。本文重點(diǎn)綜述了病原性海洋弧菌中能引發(fā)人類重要疾病的副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的致病機(jī)理以及目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于其的各種檢測(cè)方法、原理、應(yīng)用及研究進(jìn)展。

1 病原性海洋弧菌致病機(jī)理研究進(jìn)展

病原性弧菌主要通過兩種途徑引起人和動(dòng)物感染，一種為經(jīng)腸道感染引起胃腸炎或腹瀉，如副溶血弧菌、霍亂弧菌等；另一種為經(jīng)中耳炎、傷口感染引起敗血癥，如創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌等。Elston和Leibovitz［2］通過研究美洲牡蠣幼體弧菌病證實(shí)了弧菌的致病性取決于其與宿主細(xì)胞間的相互作用，包括黏附、侵襲、定居、體內(nèi)增殖、產(chǎn)生毒素及宿主死亡等致病過程，在長(zhǎng)牡蠣、歐洲扁牡蠣、硬殼蛤的許多致病性研究中也都證實(shí)了類似的結(jié)果。其致病作用主要是在其侵襲和生長(zhǎng)繁殖過程中對(duì)機(jī)體細(xì)胞、組織造成的損傷以及其代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體局部乃至全身的正常新陳代謝或機(jī)能造成的干擾和破壞。病原性弧菌的重要致病因子有如下幾種。

1.1 黏附素

細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞表面是侵入宿主并有效發(fā)揮毒素使機(jī)體感染致病的先決條件。弧菌具有多種粘附素，大體分為兩大類：菌毛粘附素和非菌毛粘附素，前者包括鞭毛、纖毛等；后者有脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）等。

多數(shù)弧菌具有運(yùn)動(dòng)性，有單根或周身鞭毛，它們可借助于這一特殊結(jié)構(gòu)粘附于消化道等器官粘膜上皮細(xì)胞表面。Nakasone等［3］發(fā)現(xiàn)從血清型為03：K2的副溶血弧菌中純化的纖毛能夠黏附在兔腸道絨毛上皮細(xì)胞上，當(dāng)用纖毛抗體Fab片段處理菌體細(xì)胞后，則會(huì)失去對(duì)兔腸道絨毛上皮細(xì)胞的黏附作用，表明纖毛在副溶血弧菌的黏附和定植過程中發(fā)揮了重要作用，并且證實(shí)侵襲力是其毒力的一部分。Uchimura等［4］報(bào)道，菌毛在創(chuàng)傷弧菌、最小弧菌的致病過程中介導(dǎo)菌體遠(yuǎn)距離的黏附，但其機(jī)理尚未清楚。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的主要成分之一，是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要物質(zhì)，具有種屬特異性。副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌的脂多糖都被證明與其致病過程有關(guān)，是重要的致病因子。

外膜蛋白（OMP）是細(xì)菌外膜的主要結(jié)構(gòu)，它不僅與粘附作用有關(guān)，而且與菌株的毒力也有密切關(guān)系，OMP還能與細(xì)菌的脂多糖（LPS）結(jié)合成復(fù)合物，該復(fù)合物不僅與細(xì)菌的自凝有關(guān)還與粘附有關(guān)。有研究顯示，霍亂弧菌的純化外膜蛋白的抗體可以抑制其在小鼠腸粘膜上的粘附。有一種分子量為77kDa的OMP，定名為IrgA，其表達(dá)受鐵濃度的調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是霍亂弧菌對(duì)小鼠有毒力的重要因素［5］。

1.2 胞外酶

目前已發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌均可產(chǎn)生胞外酶，具有多種酶活性，可產(chǎn)生強(qiáng)烈的致病作用，且致病作用大致相同：破壞宿主體質(zhì)，分解破壞其組織成分；破壞機(jī)體凝血系統(tǒng)的酶活性；破壞血細(xì)胞導(dǎo)致溶血；破壞血清的免疫功能等。

1.2.1 溶血素 溶血素是副溶血弧菌致病的主要因素，已被證明是一種細(xì)胞毒素和誘導(dǎo)酶［6］。Tanaka等研究發(fā)現(xiàn)，在有水解產(chǎn)物存在的條件下，它的產(chǎn)生量為非誘導(dǎo)條件下的40倍左右。目前研究較多的有不耐熱溶血素（TLH）、耐熱直接溶血素（TDH）、耐熱直接相關(guān)溶血素（TRH）。TLH、TDH和TRH分別由tlh、tdh和trh基因編碼。除副溶血弧菌外，非O1群霍亂弧菌也可能攜帶tdh基因，可能是因?yàn)閠dh基因通過與一段插入序列相連構(gòu)成轉(zhuǎn)移復(fù)合物在弧菌中相互傳播的原因。

TDH和TRH具有直接溶血活性，可使多種紅細(xì)胞發(fā)生溶血，人類的紅細(xì)胞對(duì)TDH較敏感。這一溶血過程是通過溶血素與宿主的紅細(xì)胞膜結(jié)合后，在其表面成孔并最終導(dǎo)致紅細(xì)胞膠樣滲透溶解來實(shí)現(xiàn)的。此外，TDH還具有細(xì)胞毒活性，可使細(xì)胞膜上形成小孔通道，引起細(xì)胞外Ca2+濃度增加，從而引起Ca2+激活的Cl-分泌增加，當(dāng)細(xì)胞滲透壓的改變超過細(xì)胞自身調(diào)節(jié)的能力時(shí)，將使細(xì)胞發(fā)生病理和形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹甚至死亡。TDH還具有腸毒素活性，心臟毒性和致死作用［7］。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，TLH是一種非典型的磷脂酶，也能夠溶解人的紅細(xì)胞，但需要卵磷脂具有溶血活性。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)無論是臨床分離株還是環(huán)境分離株都含有 tlh基因，并具有種屬特異性。Gooch等［8］利用TLH的種屬特異性對(duì)tlh制備基因探針檢測(cè)貝類等海產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)其比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法具有更加快速、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

1.2.2 金屬蛋白酶與溶細(xì)胞素 金屬蛋白酶（metaloprotease）是創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)生的一種能消化膠原和彈性蛋白的胞外酶，與宿主組織損害及皮膚水腫形成有關(guān)，通過激活血漿緩激肽的級(jí)聯(lián)放大作用，使血管通透性增大，有利于創(chuàng)傷弧菌從腹腔入侵血液，同時(shí)還通過降解Ⅳ型膠原破壞血管基底膜，最終引起皮膚出血。也有國(guó)外學(xué)者認(rèn)為金屬蛋白酶對(duì)創(chuàng)傷弧菌毒性的產(chǎn)生并不重要，在該菌的毒力中可能存在多因素相互作用，蛋白酶在其中所占的比重尚不清楚。

創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素（VVC）是由結(jié)構(gòu)基因vvhA編碼的能使細(xì)胞形成孔道的細(xì)胞毒素，由大多數(shù)致病菌株產(chǎn)生，能溶解哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞，具有血管滲透因子活性，毫克以下水平即可對(duì)腹腔注射實(shí)驗(yàn)鼠致死。目前對(duì)VVC的細(xì)胞毒性機(jī)制已有廣泛研究和報(bào)道，但其確切機(jī)制尚未完全明了，就目前的研究結(jié)論認(rèn)為其毒性是通過與靶細(xì)胞膜結(jié)合及形成跨膜孔道；發(fā)揮誘導(dǎo)作用，產(chǎn)生超氧陰離子，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，促進(jìn)一氧化氮合酶（NOS）大量釋放，引起細(xì)胞凋亡；誘導(dǎo)肥大細(xì)胞中組胺釋放；誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子；受金屬蛋白激酶等其他因素調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的［9-11］。Kim等［12］研究認(rèn)為，VVC經(jīng)膽固醇介導(dǎo)能與紅細(xì)胞膜結(jié)合并聚合成四聚體，從而在細(xì)胞膜上形成直徑約1nm的孔道。Park等［15］也報(bào)道VVC屬于孔型成蛋白中的膽固醇依賴型溶細(xì)胞素（CDC）家族。Kwon等［13］在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)VVC的濃度達(dá)到0.4HU/mL時(shí)，產(chǎn)生的超氧陰離子可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Kim等［14］研究進(jìn)一步證實(shí)VVC提高了肺內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+水平，激活了肺內(nèi)皮細(xì)胞，引起其表面黏附分子的表達(dá)增加，使肺血管通透性增大，導(dǎo)致急性肺損傷。

1.3 整合子系統(tǒng)

在霍亂弧菌的基因組上發(fā)現(xiàn)了一類整合子，它們都攜帶一個(gè)整合酶基因和一個(gè)特異性的附著位點(diǎn)，能從其他微生物捕獲外源性的開放讀碼框（ORF）或基因盒，并把它們轉(zhuǎn)化為有功能的基因?；魜y弧菌存在這樣一個(gè)獨(dú)特的整合子系統(tǒng)，可能在霍亂弧菌獲取致病基因的過程中發(fā)揮作用。目前，所發(fā)現(xiàn)的整合子多與抗生素抗性基因相關(guān)，因此與霍亂弧菌的流行性也有一定關(guān)系。

1.4 其它致病因子

研究發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌的致病性是由幾個(gè)致病因子共同作用的結(jié)果。主要致病因子有3個(gè)：CTX基因元件，其中的ctxAB基因編碼霍亂毒素（CT）；TCP致病性島，它編碼TCP菌毛；toxR，一個(gè)基本的毒力調(diào)節(jié)基因，編碼CT和TCP的基因都由toxR基因調(diào)控。Wang等［15］發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶基因位于副溶血弧菌的22.79kb致病島，它的存在與弧菌的毒力因子的相關(guān)性超過98%。

2 病原性海洋弧菌快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

近年來隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷努力，已研究了很多快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感、低耗且適用的病原菌快速檢測(cè)法，尤其是基因探針和PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，已逐漸取代傳統(tǒng)的生化實(shí)驗(yàn)，明顯提高了細(xì)菌的診斷水平。

2.1 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是一種利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，并結(jié)合一些生物化學(xué)或物理學(xué)方法而建立起來的病原檢測(cè)技術(shù)。主要包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)等。

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)（ELISA）是將抗原、抗體的特異性免疫反應(yīng)及酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合起來的一種定性和定量的綜合性技術(shù)。該技術(shù)從抗體的包被到酶聯(lián)顯色都日趨成熟和完善，易于制備試劑盒，操作簡(jiǎn)單，與其他檢測(cè)方法相比，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。目前在國(guó)內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于病原性海洋弧菌的快速檢測(cè)。但該技術(shù)也有其缺點(diǎn)，主要是制備抗體需進(jìn)行吸附處理以去除交叉反應(yīng)。何彬斌等［16］建立了副溶血弧菌的間接ELISA快速檢測(cè)法，檢出限達(dá)到了105CFU/mL，且與其它菌株均無交叉反應(yīng)，具有較高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行檢測(cè)。竇勇等［17］建立的副溶血弧菌間接ELISA快速法，將檢出限提高到104CFU/mL，與之相比提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。目前，南方醫(yī)科大學(xué)流行病學(xué)系的研究者將tlh基因進(jìn)行了克隆，制備了抗TLH多克隆抗體，同時(shí)聯(lián)合兔抗副溶血弧菌多克隆抗體建立了ELISA雙抗體夾心法。該研究雖未對(duì)其直接檢測(cè)效果做出評(píng)價(jià)，但卻為利用TLH的種特異性檢測(cè)副溶血弧菌的感染情況提供了依據(jù)［18］。

2.1.2 膠體金免疫層析技術(shù) 膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。滴加在試劑條一端的樣品受膜的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，移動(dòng)過程中目標(biāo)菌與固定在膜上某一區(qū)域的受體結(jié)合而被固相化顯色，無關(guān)物質(zhì)則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標(biāo)記物顯色來判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。膠體金免疫層析法特異性高、靈敏度好，不僅能檢測(cè)活菌，還能檢測(cè)死菌。應(yīng)用該方法對(duì)水產(chǎn)品中的霍亂弧菌進(jìn)行檢測(cè)，陰性者可直接報(bào)告，由于目前我國(guó)對(duì)霍亂弧菌的膠體金免疫層析法還沒有具體的標(biāo)準(zhǔn)，只能作為初篩實(shí)驗(yàn)，陽性者需進(jìn)一步結(jié)合生化及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分離鑒定。

2.2 基因檢測(cè)技術(shù)

基因檢測(cè)技術(shù)主要是以病原的核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分為研究對(duì)象，并結(jié)合一些生物化學(xué)手段來鑒定病原的一種檢測(cè)技術(shù)。目前在病原性海洋弧菌的檢測(cè)中應(yīng)用比較多的是基因探針技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、16SrRNA檢測(cè)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。

2.2.1 基因探針技術(shù) 基因探針技術(shù)是利用特定標(biāo)記的DNA或RNA探針和病原中與探針互補(bǔ)的靶核苷酸序列進(jìn)行雜交，以此來確定宿主是否攜帶有病原體的一類基因檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)以其檢驗(yàn)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，20世紀(jì)90年代以來，已廣泛應(yīng)用于多種病原性海洋弧菌的檢測(cè)［19］。目前，國(guó)內(nèi)外研究者已建立了多種針對(duì)編碼病原性海洋弧菌毒力基因的探針技術(shù)。美國(guó)FDA-BAM推薦利用堿性磷酸酶（AP）和地高辛（DIG）標(biāo)記DNA探針雜交檢測(cè)副溶血性弧菌的 tlh、tdh和 trh基因，采用VVAP探針進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌特異性計(jì)數(shù)。

Lee等［20］根據(jù)tdh基因的核苷序列，合成了副溶血弧菌特異性地寡核苷酸探針，可特異地與89株副溶血性弧菌分離株的DNA雜交，不與其他菌雜交；探針靈敏度約為1×106CFU/g，可直接用于人工染菌食品的檢測(cè)。Raghunath等［21］用AP標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)海產(chǎn)品中trh+的副溶血弧菌。結(jié)果表明，該探針的特異性為100%、靈敏度為5.0×102～3.4× 103CFU/g，能特異的對(duì)海產(chǎn)品中trh+的副溶血弧菌進(jìn)行快速檢測(cè)。McCarthy等［22］評(píng)價(jià)了檢測(cè)副溶血弧菌tlh基因的AP和DIG標(biāo)記探針，研究發(fā)現(xiàn)，兩種探針的特異性很好，與API20E鑒定系統(tǒng)的符合率分別為97%和98%。Lee等［23］采用基因探針的夾心雜交法檢測(cè)海產(chǎn)品副溶血弧菌的tlh基因，能把每克牡蠣組織里10個(gè)副溶血弧菌檢測(cè)出來。該方法易于制成試劑盒，目前，美國(guó)市場(chǎng)上已有銷售，該產(chǎn)品操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性好，能進(jìn)行臨床大規(guī)模的快速檢測(cè)。近年來，國(guó)外一種快速測(cè)定副溶血性弧菌總量的疏水網(wǎng)格膜過濾技術(shù)開發(fā)成功，它也是一種 DNA探針技術(shù)，增菌后 1d即可完成測(cè)定［24］。

Nair等［25］在研究O139群和O抗原基因中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)O139群特異片段2R1和2R3，2R1長(zhǎng)100bp，2R3長(zhǎng)1000bp，可將它們尤其是2R3作為探針，用于O139群的特異檢測(cè)。Wright等［26］根據(jù)創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素結(jié)構(gòu)基因vvhA，合成了AP標(biāo)記寡核苷酸探針（VVAP），雜交結(jié)果與脂肪酸圖譜和API20E的鑒定結(jié)果一致，該探針可直接檢測(cè)天然污染和人工染菌的環(huán)境樣品，無需進(jìn)行增菌或選擇性平板分離。

2.2.2 熒光定量PCR技術(shù) 熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)熒光能量傳遞原理，融合了PCR技術(shù)的高效性，探針技術(shù)的高特異性，光譜技術(shù)的高敏感性和高精確性等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為分子生物學(xué)中一種強(qiáng)有力的快速檢測(cè)手段。熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為 TaqMan熒光探針和 SYBR熒光染料。Blackstone等［27］建立了1種基于TaqMan探針的快速定量檢測(cè)含tdh基因副溶血弧菌的熒光定量PCR方法，該實(shí)驗(yàn)的DNA靈敏度為1CFU/PCR體系，實(shí)驗(yàn)快速、準(zhǔn)確，整個(gè)反應(yīng)1h內(nèi)就可完成。Ward等［28］建立了基于TaqMan探針檢測(cè)貝類中副溶血弧菌tlh、tdh、trh和ORF8基因的復(fù)合熒光定量PCR方法，可用于檢測(cè)基因組DNA和純培養(yǎng)物，其靈敏度分別為200pg和1×104CFU/mL。Panicker等［29］建立了采用SYBR Green 1DNA結(jié)合染料檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌vvhA基因的熒光定量PCR方法，84株創(chuàng)傷弧菌都出現(xiàn)陽性擴(kuò)增結(jié)果，非目標(biāo)弧菌的擴(kuò)增結(jié)果都為陰性，牡礪組織或海水的檢出限為100CFU，增菌5h檢出限降至1CFU。曲梅等［30］建立了基于TaqMan探針檢測(cè)霍亂弧菌ctxAB和zot毒力基因的熒光定量PCR方法。該方法檢測(cè)其他腸道致病菌無交叉反應(yīng)，檢測(cè)限可達(dá)到2～20CFU/mL。

隨著生態(tài)環(huán)境的變化和抗生素的濫用，許多致病菌引起的臨床癥狀越來越不典型，常常需要同時(shí)檢測(cè)多種致病基因才能確定病原。而多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)為同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因或多種細(xì)菌提供了可能，對(duì)各類病原性海洋弧菌的監(jiān)控檢測(cè)有著重要的價(jià)值。

2.2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種新的分子生物學(xué)方法，它在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增。該技術(shù)依賴于能夠識(shí)別靶DNA上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，1h即可完成，反應(yīng)產(chǎn)物是由多重復(fù)靶序列的莖-環(huán)狀和花椰菜狀DNA組成的混合物，具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)［31］。目前，該技術(shù)在臨床疾病的診斷、流行性細(xì)菌或病毒的定性、定量檢測(cè)以及環(huán)境安全監(jiān)測(cè)等方面應(yīng)用廣泛。應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測(cè)病原性海洋弧菌國(guó)外未見文獻(xiàn)報(bào)道，近兩年，國(guó)內(nèi)學(xué)者開發(fā)出了檢測(cè)副溶血弧菌的LAMP方法，具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。徐芊等［32］建立了副溶血弧菌LAMP檢測(cè)方法，1h即可完成。針對(duì)副溶血弧菌tlh基因，設(shè)計(jì)了4條特異性引物，對(duì)12種細(xì)菌共28株菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，僅副溶血弧菌得到陽性結(jié)果；副溶血弧菌基因組DNA和純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度分別為90fg/LAMP反應(yīng)體系和24CFU/mL，檢測(cè)限為89CFU/g。研究表明，該方法檢測(cè)副溶血弧菌特異性強(qiáng)、靈敏度高，并且操作簡(jiǎn)便、快捷、檢測(cè)成本低。王麗等［33］利用LAMP法對(duì)市售不同水產(chǎn)品來源的副溶血弧進(jìn)行快速檢測(cè)，同時(shí)將檢測(cè)結(jié)果與PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，LAMP方法的最低檢出限為10CFU/mL，PCR方法為103CFU/mL，LAMP方法檢測(cè)靈敏度是PCR方法的100倍，特別適合于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。

2.2.4 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是近年發(fā)展起來的，廣泛應(yīng)用于基因序列分析、雜交、基因突變檢測(cè)、基因組文庫(kù)圖型分析以及致病菌基因診斷等領(lǐng)域的一項(xiàng)技術(shù)［34］。該技術(shù)可同時(shí)將大量不同的探針固定于同一支持物上，因而可以一次性對(duì)同一樣品進(jìn)行大量序列檢測(cè)和核酸分析，能夠滿足在實(shí)際檢驗(yàn)工作中的快速、高通量、自動(dòng)化檢測(cè)的要求，并可以克服上述其他技術(shù)存在的問題，具有廣闊的發(fā)展前景。國(guó)內(nèi)外關(guān)于應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物疾病方面的研究均處于起步階段。Gonzalez等［35］用多重PCR和由9種短核苷酸探針構(gòu)建DNA芯片的方法，同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌與創(chuàng)傷弧菌等5種病原性海洋弧菌，7種與病原菌染色體互補(bǔ)的探針檢測(cè)靈敏度為100%。Panicker等［36］建立了檢測(cè)和鑒定牡蠣中副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的DNA芯片方法。結(jié)果證明，用基因芯片能成功檢測(cè)到1g牡蠣組織均漿中1CFU的弧菌，對(duì)這3種弧菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能廣泛、可靠、靈敏的分析。

2.3 變性高效液相色譜技術(shù)

變性高效液相色譜（DHPLC）是利用離子對(duì)反向高效液相色譜原理，通過一個(gè)DNA分離柱，進(jìn)行核苷酸片段的分離和分析，是近幾年發(fā)展起來的一種快速檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的新技術(shù)。具有自動(dòng)化、快速、檢出率高、檢測(cè)DNA片段大小范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已被證實(shí)為一種高性價(jià)比的檢測(cè)技術(shù)。曹際娟等［37］以PCR-DHPLC法對(duì)54株霍亂弧菌參考菌株進(jìn)行了檢測(cè)，并和常規(guī)分離培養(yǎng)進(jìn)行了比較，陽性率為19%，與常規(guī)分離培養(yǎng)比較，符合率為100%。這種檢驗(yàn)方法特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快捷，為霍亂防治提供了一種有效的檢測(cè)新手段。

2.4 顯色培養(yǎng)基技術(shù)

顯色培養(yǎng)基技術(shù)是近年來開發(fā)的新型快速檢測(cè)法，通過在分離培養(yǎng)基中加入細(xì)菌特異性酶的顯色底物，直接根據(jù)菌落顏色就可以對(duì)菌種做出鑒定，減少了進(jìn)行純培養(yǎng)和生化鑒定的步驟，極大提高了檢測(cè)效率。張淑紅等［38］設(shè)計(jì)開發(fā)了一種靈敏性與CHROMagar vibrio和TCBS平板相當(dāng)?shù)?、用于分離檢測(cè)副溶血弧菌的新型顯色培養(yǎng)基HKC vibrio，可應(yīng)用于人工污染樣品和實(shí)際樣品檢驗(yàn)。近年來，有研究人員也開發(fā)出一種比TCBS具有更強(qiáng)特異性的、用于副溶血弧菌分離檢測(cè)的選擇性顯色培養(yǎng)基BCVM。副溶血性弧菌在BCVM上形成紫色菌落，能明顯區(qū)分創(chuàng)傷弧菌形成的藍(lán)綠色菌落。經(jīng)分別采用BCVM和TCBS對(duì)來自于牡蠣及其生長(zhǎng)環(huán)境的296株副溶血弧菌進(jìn)行比較研究，結(jié)果顯示BCVM選擇性為94%，而TCBS僅達(dá)77%［39］，該結(jié)果提示BCVM有可能成為一種直接平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，用于食品中副溶血弧菌的快速定量檢測(cè)。鑒于BCVM的高度特異性，研究人員開發(fā)出一種類似于傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法的，用于副溶血性弧菌定量的雙層培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法（DLAP）。該培養(yǎng)基有兩層，底層為BCVM，上層為含1.5%NaCl的TSA。經(jīng)驗(yàn)證，該方法能有效恢復(fù)受熱或冷傷害的副溶血弧菌的活力，可以作為MPN法的一種替代方法，用于副溶血性弧菌的快速測(cè)定［40］。

3 前景與展望

病原性海洋弧菌的檢測(cè)技術(shù)已由傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)法發(fā)展到免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，其方法由簡(jiǎn)單到復(fù)雜，檢測(cè)結(jié)果也越趨精確。分子生物學(xué)技術(shù)可從基因水平考察細(xì)菌的流行病學(xué)狀況，不僅能檢出陽性菌株，還能判定其是否攜帶毒力基因，能夠?yàn)槭吃葱约膊〉牧餍胁W(xué)調(diào)查提供有力的支持，大大提高了預(yù)防、撲滅疾病爆發(fā)的能力。微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域尚有一些實(shí)用性較強(qiáng)的方法。例如，生物傳感器技術(shù)、免疫磁性分離技術(shù)、焦磷酸測(cè)序技術(shù)等，其中不少可以制成商品試劑盒或?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化。然而，各種快速檢測(cè)方法各有其長(zhǎng)處和不足，在定性與精確定量?jī)煞矫骐y以兼顧。就目前國(guó)內(nèi)外研究情況來看，分子生物學(xué)技術(shù)在科研領(lǐng)域中應(yīng)用較多，通常用在流行病學(xué)研究中，考察細(xì)菌的來源、傳播途徑和地域性差別，在實(shí)際檢驗(yàn)工作中由于相對(duì)要求較高，推廣應(yīng)用上有一定難度。值得注意的是，近年來基因芯片技術(shù)已成為檢驗(yàn)領(lǐng)域里強(qiáng)有力的武器，能夠?qū)崿F(xiàn)如副溶血弧菌等病原微生物的自動(dòng)化檢驗(yàn)。如果能形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模效應(yīng)，大大降低成本后，不論在科研領(lǐng)域還是生產(chǎn)實(shí)踐中都有十分廣闊的應(yīng)用空間。目前，病原性海洋弧菌的檢測(cè)，應(yīng)視具體情況靈活掌握，應(yīng)將傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法、現(xiàn)代免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法三種技術(shù)結(jié)合起來應(yīng)用，充分發(fā)揮其綜合優(yōu)勢(shì)，方能達(dá)到既快速準(zhǔn)確，又經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的目的。

［1］TubiashHS，ColwellRR，SakazskiR.Marinevibrios associated with bacillary necrosis［J］.J Baeteriol，1970，103：272-273.

［2］Elston R，Leibovitz L.Pathogenesis of experimental vibrioeis in larval American oysters，Crassostrea virginica［J］.Can J Fish Aquat Sci，1980，39：964-978.

［3］Nakasone N，Iwanaga M.Pili of a Vibrio parahaemolyticus strain as a possible colonization factor［J］.Infect Immun，1990，59（1）：61-69.

［4］Uchimura M，Yamamoto T.Production of hemagglutinins and pili by Vibrio minicus and its adherence to human and small intestines in vitro［J］.FEMS Microbiol Lett，1992，91：73-78.

［5］Mey AR，Wyckoff EE，Oglesby AG，et al.Identification of the Vibrio cholerae enterobactin receptors VctA and IrgA：IrgA is not required for virulence［J］.Infect Immun，2002，70（7）：419-426.

［6］Takeshi H，Yuxin N，Yoshio M.The thermostable direct hemolysin of vibrio parahaemolyticus is a pore-forming toxin［J］.J Microbiol，1992，38：1175-1180.

［7］Franeesco R，Joseph P，Carla F，et al.Enterotoxicity and cytotoxicity ofVibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin in vitro systems［J］.Infect Immun，2000，68：3180 -3191.

［8］Gooch JA，DePaola A，Kaysner CA，et al.Evaluation of two direct plating methods using nonradioactive probes for enumeration of Vibrio parahaemolyticus in oysters［J］.Appl Environ Mierobiol，2001，67（2）：721-724.

［9］Haq SM，Dayal HH.Chronic liverd disease and consumption of rawoysters：a potentially lethal combination-a review of Vibrio vulnificus septicemia［J］.Am J Gastroenterol，2005，100（5）：1195 -1199.

［10］Park KH，Yang HB，Kim HG，et al.Low density lipoprotein inactivates Vibrio vulnificus cytolysin through the oligomerization of toxin monomer［J］.Med Microbiol Immunol（Berl），2005，194（3）：137-141.

［11］Lee YR，Park KH，Lin ZZ，et al.A calcium-calmodulin antagonist blocksexperimentalVibrio vulnificuscytolysininduced lethality in an experimental mouse model［J］.Infect Immun，2004，72（10）：6157-6159.

［12］Kim HR，Rho HW，Jeong MH，et al.Hemolytic mechanism of cytolysin produced from v.vulnificus［J］.Life Sci，1993，53（7）：571-577.

［13］Kwon KB，Yang JY，Ryu DG，et al.Vibrio vulnificus cytolysin induces superoxide anion-initiated apoptotic signaling pathway in human ECV304 cells［J］.J Biol Chem，2001，276（50）：47518-47523.

［14］Kim BS，Kim JS.Vibrio vulnificus cytolysin induces hyperadhesiveness of pulmonary endothelial cells for neutrophils through endothelial P-selectin：a mechanism for pulmonary damage by Vibrio vulnificus cytolysin［J］.Exp Mol Med，2002，34：308-312.

［15］Wang HZ，Wang WM，O’Toole D，et al.Identification of a DNA methyltransferase gene carried on a pathogenicity island like element（VPAI）in Vibrio parahaemolyticus and its prevalence among clinical and environmental isolates［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72：4455-4460.

［16］何彬斌，鐘青萍，王斌.抗副溶血弧菌IgY的提純及檢測(cè)副溶血弧菌的間接ELISA的建立［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（4）：95-99.

［17］竇勇，寧喜斌.副溶血弧菌間接ELISA快速檢測(cè)法的建立［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（6）：205-209.

［18］杜玉萍，陳清，柯雪梅，等.抗副溶血弧菌TLH蛋白多克隆抗體的制備及其ELISA雙抗體夾心檢測(cè)法的研究［J］.華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007（1）：19-21.

［19］Eiler H.Culturability and in situ abundance of pelagic bacteria from the North Sea［J］.Appl Environ Microbio1，2000，66（7）：3044-3051.

［20］Lee C，Chen LH，Liu ML，et al.Use of an oligonucleotide probe to detect Vibrio parahaemolyticus in artificially contaminated oysters［J］.Appl Environ Microbiol，1992，58：3419 -3422.

［21］Raghunath P，Pradeep B，Karunasagar I，et al.Rapid detection and enumeration of trh - carrying Vibrio parahaemolyticus with the alkaline phosphatase- labelled oligonucleotide probe［J］.Environ Microbiol，2007（9）：266-270.

［22］McCarthy SA，Depaola A，Cook DW，et al.Evaluation of alkaline phosphatase and digoxigeninlabelled probes for detection of the thermolabile hemolysin（ tlh）gen e of Vibrio Parahaemolyticus［J］.Lett Appl Microbiol，1999，28（1）：66-70.

［23］Lee CY，Panicker G，Bej AK.Detection of pathogenic bacteria in shellfish using multiplex PCR followed by covalink NH microwell plate sandwich hybridezation［J］.J Microbiol Methoeds，2003，53（2）：199-209.

［24］Banerjee SK，Pandlan S，Todd EC，et al.Arapid and improved method for the detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus strains grown on hydrophobic grid membrane filters［J］.J Food Prot，2002，65：1049-1053.

［25］Nair GB，Bag PK，Shimada T，et al.Evaluation of DNA probes for specific detection of Vibrio chloerae O139 Bengal［J］.J Clin Microbiol，1995，33：2186-2187.

［26］Wright AC，Miceli GA，Landry Wl，et al.Rapid identification of Vibrio vulnificus on nonselective media with an alkaline phosphatase-labeled oligonucleotide probe［J］.Appl Environ Microbiol，1993，59（2）：541-546.

［27］Blackstone GM，Noalsmxn JL，Viekery MC，et al.Detection of pathogenic in oyster enrichments by real time PCR［J］.J Microbiol Methods，2003，53：149-155.

［28］Ward L N，Bej AK.Detection of vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of multiplexed real-time PCR with TaqMan fluorescent probes［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72（3）：2031-2042.

［29］Panicker G，Myers ML，Bej AK.Rapid detection of Vibrio vulnificus in shellfish and Gulf of Mexico water by real-time PCR［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70（1）：498-507.

［30］曲梅，黃芳，嚴(yán)寒秋，等.TaqMan熒光PCR技術(shù)在霍亂弧菌毒力基因檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，9（6）：546-549.

［31］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Research，2000，28（12）：63.

［32］徐芊，孫曉紅，趙勇，等.利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的副溶血弧菌［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，16（5）：780-786.

［33］王麗，李琳，山崎伸二，等.新型恒溫核酸擴(kuò)增法快速檢測(cè)副溶血性弧菌的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（7）：382-385.

［34］Call DR，Boruchi MK，loge FJ，et al.Detection of bacterial pathogens in environmental samples using DNA microarrays［J］.J Microbiol Methods，2003，53：235.

［35］Gonzalez SF，Krug MJ，Nielsen ME，et al.Simultaneous detection of marine fish pathogens by using multiplex PCR and a DNA microarray［J］.J Clinical Microbiology，2004，42（4）：1414 -1419.

［36］Panicker G，Call DR，Krug MJ，et al.Detection of pathogenic vibro spp in shellfish by using multiplex PCR and microarrays［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70（12）：7436-7444.

［37］曹際娟，閆平平，于珂，等.變性高效液相色譜檢測(cè)霍亂弧菌［J］.遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，31（3）：347-352.

［38］張淑紅，吳清平，張菊梅，等.副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基檢測(cè)效果初步評(píng)價(jià)［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（1）：145-148.

［39］Duan J，Su YC.Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibro parahaemolyticus［J］.J Food Sci，2005，70（2）：125-128.

［40］Duan J，Liu C，Su YC.Evaluation of a double layer agar plate for direct enumeration of Vibro parahaemolyticus［J］.J Food Sci，2006，71（2）：77-82.

Research progress in pathogenetic mechanism and rapid detection of pathogenicm marine vibrio

XIA Fan，YANG Li-jun*，WANG Jing，LI Zhao-jie，LIU Yu-min
（Weihai Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau，Weihai 264200，China）

Pathogenicm marine vibrio is recognized as a principal pathogenetic microorganism which could cause disserve of bacterial food poisoning in China specially in littoral of our country.Vibrio parahaemolyticus，Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus could cause serious disease of human.Pathogenetic mechanism，methods of rapid detection，principles，application and research progress in the world of the three vibrios were summarized.

pathogeny；marine vibrio；rapid detection；research progress

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0366-06

2009-12-04 *通訊聯(lián)系人

夏凡（1983-），男，碩士，研究方向：食品安全檢測(cè)。