超聲波提取炒王不留行總三萜的工藝優化及其抑菌活性研究

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(河南省生物技術開發中心,河南省植物天然產物開發工程技術研究中心,河南鄭州 450002)

王不留行為石竹科植物麥藍菜(Vaccariasegetalis(Neck)Garcke)的干燥成熟種子[1],中醫臨床常用中藥,多以炒制入藥[2-3],主要含有三萜皂苷、黃酮苷、環肽、類脂、脂肪酸和單糖等成分[4],具行血通經、催生下乳、消腫斂瘡之功效[5]。

三萜類化合物具有較強的抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、降血糖、調控免疫等重要生物活性功能[6],而備受關注。相關研究表明王不留行總皂苷具有抑制新生血管的作用[7-13]。目前已分離得到了27個三萜皂苷[3],其母核結構均為五環三萜的齊墩果烷型或它的變形[14],藥理活性研究表明,這些皂苷成分具有細胞毒活性和黃體細胞生長抑制作用[15-17]。因此,研究王不留行三萜皂苷提取工藝,對其藥用開發與利用具有重要意義。目前只有洪奎等[18-19]利用正交設計法以總皂苷質量分數和干粉得率為綜合評價指標考察了王不留行總皂苷的提取工藝,而未見其它關于優化王不留行總三萜提取工藝及其抑菌活性研究的報道。傳統的正交試驗方法雖然能夠同時考慮幾種影響因素,尋找最佳因素水平組合,卻不能在給出的整個區域上找出因素和響應值間的明確的函數表達式,即回歸模型,從而無法找到整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值[20]。

基于此,本實驗采用單因素實驗與Box-Behnken設計法對炒王不留行總三萜的超聲輔助提取工藝進行優化研究,確定最佳工藝參數,并對所提取的總三萜進行了抑菌作用研究,以期為該植物資源的充分、合理開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

炒王不留行(FriedVaccariasegetalis) 河南鄭州中草藥批發市場,產地河北,由河南中醫藥大學生藥學專家董誠明教授鑒定,為炒王不留行正品,置于50 ℃恒溫干燥箱內烘干24 h后,粉碎過40目篩備用;大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 29213、化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC 19615、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC 13311、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC 49619,銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 27853,肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC 700603 以上7株實驗菌株凍干菌種購自南京便診生物科技有限公司;糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、都柏林沙門氏菌(Salmonelladublin) 以上3株實驗菌株凍干菌種為河南省科學院天然產物重點實驗室保存菌種;胰蛋白胨 上海寶錄生物科技有限公司;牛肉浸膏 北京雙旋微生物培養基制品廠;齊墩果酸標準品(批號121213,純度≥98%) 成都普菲德生物技術有限公司;微量MIC測定板 美國Corning公司;無水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸 以上均為分析純,購于北京化工廠。

ME-204型電子天平 美國Mettler公司;YJ-VS-2型超凈工作臺 無錫一凈凈化設備有限公司;SYQ-DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;wi93008型麥氏比濁儀 北京東西儀科技有限公司;DHP-9082型電熱恒溫培養箱 上海紅華儀器有限公司;KQ-500E型超聲波清洗儀(功率500 W,頻率40 KHz) 昆山市超聲儀器有限公司;114搖擺式四兩裝高速中藥粉碎機 瑞安市永歷制藥機械有限公司;TU-1810型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;DHG-9055A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;EYELA N-1100型旋轉蒸發儀 上海愛郎儀器有限公司;SHB-III型水循環式真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;XMTD-7000型恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 王不留行總三萜的制備 精密稱取炒王不留行粗粉1.0 g,置于100 mL 錐形瓶中,按相應液料比加入設定體積分數的乙醇溶液,封口膜密封后置于超聲波洗滌器中,按相應超聲溫度和超聲時間進行提取(40 KHz頻率固定),重復三次,濾液合并后濃縮定容,取適量測定三萜類化合物含量。

1.2.2 標準曲線的制定 以齊墩果酸為標準品,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法測定總三萜含量,參照劉曉艷等[21]方法略有改動。精密稱取干燥至恒重的齊敦果酸標準品4.0 mg,置入10 mL容量瓶,加入甲醇定容至刻度,即得0.4 mg/mL的對照品溶液。精密吸取對照品溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL分別加入10 mL容量瓶中,60 ℃水浴揮干溶劑,然后加入0.4 mL新配制的5 g/100 mL香草醛-冰醋酸溶液和l mL高氯酸,搖勻后置于60 ℃水浴30 min,冷卻至室溫,加冰醋酸定容至10 mL搖勻,在550 nm波長處測定吸光值。以齊敦果酸質量x為橫坐標,吸光度y為縱坐標,繪制標準曲線,得到線性回歸方程:Y=2.8175x-0.0073,R2=0.9992。說明齊墩果酸標準品在0～0.02 mg/mL內線性關系良好。

1.2.3 王不留行總三萜含量及得率的測定 精密吸取各設定條件下提取的王不留行樣品0.2 mL置于10 mL容量瓶中,按照1.2.2中的方法進行測定。根據標準曲線回歸方程,由吸光度求出提取液中的總三萜質量濃度,并按照下式計算各處理的總三萜得率。

總三萜得率(%)=(總三萜質量濃度×提取液體積×稀釋倍數)/炒王不留行粉末質量×100

1.2.4 單因素實驗設計

1.2.4.1 乙醇濃度對王不留行總三萜得率的影響 在料液比 1∶20 (g/mL)、超聲溫度50 ℃、超聲時間50 min的條件下,乙醇濃度分別為20%、40%、60%、80%、100%時,以總三萜得率為考核指標,考察乙醇濃度對王不留行總三萜得率的影響。

1.2.4.2 料液比對王不留行總三萜得率的影響 在乙醇濃度 60%、超聲溫度50 ℃、超聲時間 50 min的條件下,料液比分別為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)時,以總三萜得率為考核指標,考察料液比對王不留行總三萜得率的影響。

1.2.4.3 超聲溫度對王不留行總三萜得率的影響 在乙醇濃度 60%、料液比 1∶25 (g/mL)、超聲時間50 min的條件下,超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃時,以總三萜得率為考核指標,考察提取溫度對王不留行總三萜得率的影響。

1.2.4.4 超聲時間對王不留行總三萜得率的影響 在乙醇濃度 60%、料液比 1∶25 (g/mL)、超聲溫度60 ℃的條件下,超聲時間分別為20、40、60、80、100 min時,以總三萜得率為考核指標,考察料液比對王不留行總三萜得率的影響。

1.2.5 響應面優化試驗設計 在單因素試驗的基礎上,根據Box-Behnken試驗設計原理,以乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)和超聲時間(D)作為因素,以總三萜得率(Y)為考察值,設計4因素3水平的響應面試驗分析優化王不留行總三萜提取工藝。試驗設計因素水平見表 1。

表1 響應曲面實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels in the response surface design

1.2.6 抑菌活性測定

1.2.6.1 王不留行總三萜藥液母液配制 將王不留行總三萜提取物用乙醇-水(1∶1)作溶劑配制成濃度為80 mg/mL的母液。

1.2.6.2 菌株復蘇及菌懸液的制備 將上述10種供試菌種進行斜面復蘇,復蘇后接種在固體培養基平板上,37 ℃培養12～24 h,將活化的細菌傳種于液體培養基,37 ℃培養 16～18 h;再傳種于液體培養基,增殖培養 2～6 h,用液體培養基稀釋制成濃度為106～108CFU/mL的菌懸液,備用。

1.2.6.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用倍比稀釋法[22]測定王不留行總三萜的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)。將1.2.6.1中制備的藥液母液過0.22 μm濾膜,再用液體培養基依次倍比稀釋9個濃度,即濃度依次為40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16 mg/mL。

將母液及稀釋成不同濃度的藥液依次加入微量MIC測定板中,每孔0.1 mL;再分別加入已稀釋好的各種菌液,每孔0.1 mL。每種分別設置陽性對照(加入0.1 mL菌液和0.1 mL液體培養基)和陰性對照(只加液體培養基),制備好的微量MIC測定板于37 ℃恒溫箱中培養24 h觀察結果,完全沒有細菌生長時的最低濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

1.2.6.4 最小殺菌濃度(MBC)的測定 取定量上述無細菌生長的各孔取樣分別涂布于相應的無菌瓊脂平板上,于37 ℃條件下培養24 h,觀察結果,以平板上無細菌生長的最低藥物濃度為MBC。

1.3 數據處理

單因素實驗數據運用Origin 7.5軟件繪制趨勢曲線圖;采用 Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應曲面實驗設計、數據分析和二次模型的建立,通過對回歸方程的解析以及響應曲面的分析獲得最佳變量水平,通過F值考察(p<0.05)模型及因素的顯著性。所有實驗重復3次,取平均值。

2 結果與分析

2.1 炒王不留行總三萜提取單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對炒王不留行總三萜得率的影響 由圖1可知,在乙醇濃度60%之前總三萜得率增加趨勢比較明顯,60%之后總三萜得率緩慢下降,這可能是由于乙醇濃度提高會使炒王不留行中一些醇溶性雜質、色素及親脂性強的成分溶出量增加,從而影響炒王不留行總三萜的得率。因此,選擇60%乙醇為最佳提取濃度。

圖1 乙醇濃度對三萜得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on triterpenoids yield

2.1.2 料液比對炒王不留行總三萜得率的影響 由圖2可知,隨著料液比增加,炒王不留行總三萜的得率呈上升趨勢;當料液比達到1∶25 (g/mL)時,總三萜得率達到最高;繼續增大料液比,總三萜得率呈下降趨勢。當溶劑量達到25倍時,炒王不留行中三萜類化合物基本完成從固相向溶劑相的轉移,再提高溶劑量會使其他成分溶出增加,反而影響總三萜的提取,同時還會增加后續處理成本,因此,基于經濟方面考慮,料液比1∶25 g/mL為宜。

圖2 液料比對三萜得率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on triterpenoids yield

2.1.3 超聲溫度對炒王不留行總三萜得率的影響 由圖3可知,隨著超聲溫度的升高,總三萜得率不斷增大,60 ℃時總三萜得率最高,超過此溫度后總三萜得率下降,可能是由于溫度過高對炒王不留行中三萜類化合物造成了一定程度的破壞,同時溫度的加大也會增加雜質的溶出,影響總三萜測定,故選擇超聲溫度在60 ℃。

圖3 超聲溫度對三萜得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonication temperature on triterpenoids yield

2.1.4 超聲時間對炒王不留行總三萜得率的影響 由圖4可知,隨著超聲時間延長,總三萜得率先增大后降低,在40 min時達到最大。原因可能是隨著超聲時間的增加細胞破碎也增加,使得總三萜溶出更容易;達到一定時間時細胞基本破碎完成,繼續延長超聲時間,會使三萜發生一些轉化反應,同時雜質溶出也會增加,反而降低了提取效果,故選擇最佳超聲時間為40 min。

圖4 超聲時間對三萜得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonication time on triterpenoids yield

2.2 響應曲面法優化炒王不留行三萜的提取工藝

2.2.1 響應面實驗設計與結果 根據RSM的設計結果將乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)和超聲時間(D)作為自變量,三萜得率作為響應值即因變量,設計4因素3水平響應面實驗,共計29組試驗點,其中5組中心試驗點,每組試驗做3次平行,響應面實驗設計和實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計方案和實驗結果Table 2 Matrix and experiments results of response surface methodology

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗 采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行多元回歸擬合、得到炒王不留行總三萜得率(Y)對乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)和超聲時間(D)的二次多項回歸模型為:Y=1.2324+0.079333A+0.07425B+0.02925C+0.0775D+0.0595AB+5E-004AC+0.0335AD+0.03775BC+0.0455BD-0.0235CD-0.25674A2-0.24362B2-0.040367C2-0.069492D2。

對該模型方程進行方差分析和顯著性檢驗,結果見表3?？梢娫摶貧w方程模型極顯著(p<0.0001);失擬項p=0.7874>0.05,表明失擬不顯著,即該模型對本試驗擬合程度良好;模型的相關系數R2=0.9754,校正決定系數RAdj2=0.9507,說明該模型能解釋95.07%響應值的變化,即該模型與實際試驗擬合程度良好,試驗誤差較小,預測相關系數PredR2為0.9009,說明該模型預測性良好,因此用該模型分析和預測炒王不留行中總三萜的得率是合適的?；貧w模型的一次項A、B、D極顯著(p<0.01),C顯著(p<0.05);二次項A2、B2極顯著(p<0.01),C2、D2顯著(p<0.05);交互項AB、BD、CD顯著(p<0.05),其余均不顯著,說明不同提取條件與炒王不留行總三萜得率之間不是簡單的線性關系。影響炒王不留行總三萜得率由大到小的因素為A>D>B>C,即乙醇濃度>超聲時間>料液比>超聲溫度。

表3 二次回歸模型的方差分析結果Table 3 Analysis of variance for each term of developed quadratic regression model

2.2.3 響應面交互作用分析 為確定乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)和超聲時間(D)及其交互作用對炒王不留行總三萜得率的影響,根據回歸方程繪出響應面圖,如圖5所示。

圖5 各兩因素交互作用對炒王不留行總三萜得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface of two factors interaction effects on the extraction of total triterpenoids from fried Vaccaria segetalis

由圖5可知,響應面均為開口向下的凸形曲線,說明響應值存在極高值,6個圖形的等高線中心均位于-1～1,表明炒王不留行總三萜提取最優條件存在于所設計的因素水平范圍之內。響應面坡度陡峭程度可以反映交互效應的強弱,響應面坡度越陡峭,表明響應值對于因素的改變越敏感,反之曲面越平緩表明因素的改變對于響應值的影響越小[23]。圖5(a～f)直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響,乙醇濃度和液料比、液料比和超聲時間、超聲溫度和超聲時間交互作用曲面陡峭,表明其對炒王不留行總三萜得率的交互作用明顯。分析圖5a三維曲面圖可以看出,乙醇濃度曲面比料液比曲面坡度陡峭,即固定其他因素不變,討論乙醇濃度與料液比交互作用對炒王不留行總三萜得率影響大小,改變乙醇濃度對總三萜得率影響較料液比大。同理可對其它兩因素交互作用的三維曲面圖進行分析。

2.2.4 最佳條件的確定及驗證實驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得到,超聲輔助提取炒王不留行中總三萜化合物的最優提取工藝為:乙醇濃度64.6%、料液比1∶26.3 (g/mL)、超聲溫度63 ℃、超聲時間41.3 min。考慮到實際操作的方便性,將最佳提取工藝參數修正為:乙醇濃度65%、料液比1∶25 (g/mL)、超聲溫度63 ℃、超聲時間40 min。在此優化工藝下進行5次驗證實驗,實際測得的炒王不留行中總三萜得率為1.24%±0.003%,與理論預測值(1.28%)比較,其相對誤差約為3.23%,說明基于響應曲面法所得的優化提取工藝參數準確可靠,對于超聲輔助提取炒王不留行總三萜化合物的工藝有實際參考意義。

2.3 抑菌試驗結果

由表4可知,炒王不留行總三萜化合物對所選10種常見致病菌的最小抑菌濃度(MIC)范圍在1.25～20 mg/mL,尤其是對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌和肺炎鏈球菌抑制作用最強。與其它中藥如紫芝胞外三萜[24](對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌MIC均為 25 mg/mL)和赤芝菌體三萜[25](對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌MIC均為30 mg/mL)相比,炒王不留行總三萜的抑菌活性更強,并具有廣譜性,對革蘭氏陽性和陰性菌均有良好的抑制活性。因此,炒王不留行總三萜具有被研究開發成廣譜抗菌劑的潛在應用價值。

表4 炒王不留行總三萜對10種常見致病菌MIC/MBC的測定結果Table 4 MIC/MBC(mg/mL)of 10 pathogenic bacteria by total triterpenoids from fried Vaccaria segetalis

3 討論與結論

在單因素試驗基礎上,采用響應面法對炒王不留行總三萜的超聲輔助提取工藝進行了優化,確定最佳提取工藝條件為:乙醇濃度65%、料液比1∶25 (g/mL)、超聲溫度63 ℃、超聲時間40 min;在此條件下,炒王不留行總三萜得率為1.24%±0.003%,與模型預測的提取率誤差較小,說明利用響應曲面法所得的優化提取工藝參數準確可靠。洪奎等[18-19]采用正交實驗也對王不留行總皂苷的超聲輔助提取工藝進行了優化,其最佳超聲提取工藝為乙醇濃度70%、料液比1∶15 (g/mL)、超聲功率640 W、超聲時間40 min,在此最優條件下,干粉得率7.34%,總皂苷質量分數10.92,該正交最優工藝的提取效率遠低于本實驗,其原因除與王不留行的產地、采摘季節及炮制工藝等有關外,最主要原因是超聲輔助提取的工藝條件不同所致,這說明響應面法能更好的反應了各因素之間的相互作用,是比正交設計更好的一種優化方法。

本研究結果發現,炒王不留行總三萜提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌和嗜麥芽窄食單胞菌等5種受試菌種MIC在1.25～5 mg/mL,而粗提物最小抑菌濃度低于8 mg/mL時就被認為其有潛在的治療價值[26],因此炒王不留行三萜類物質具有良好的抗菌開發價值。

本實驗為研究炒王不留行總三萜的抑菌活性提供了一定的基礎性實驗依據,對王不留行資源的開發利用具有一定的指導意義。但有關炒王不留行總三萜體內抗菌活性評價和起主要抑菌作用的三萜化合物種類有待進一步研究。