大鼠胚胎冷凍保存技術及研究進展

張 麗,譚竹鈞,劉 牧

(1.廣東工業大學 輕工化工學院，廣東 廣州 510006；2.中國醫學科學院 醫學實驗動物研究所，北京 100021)

大鼠是常用實驗動物之一，在生命科學和醫學研究領域中均有較高應用價值。隨著大鼠基因序列測序的完成和基因敲除技術的發展，通過轉基因、基因敲除等生物工程技術已成功建立的人類大鼠疾病模型日漸增多，如高血壓大鼠、心臟病大鼠、糖尿病大鼠等。以常規的繁殖方式維持這些大鼠品系，不但需要大量的飼養空間和維持經費，還可能隨時發生遺傳變異、漂移和遺傳污染[1]。通過冷凍保存大鼠胚胎的方法建立冷凍胚胎庫，不僅可以防止由各種原因造成有價值的品系和稀有突變體品系的丟失；預防群體內的遺傳變異，漂移和遺傳污染；防止疾病的傳播等。此外，冷凍胚胎保種，還便于運輸和進行地區間和國際間的交流。

大鼠胚胎冷凍技術最早由Whi t tingham等[2]建立，首次利用二甲基亞砜(DMSO)作為冷凍保護劑，通過慢速冷凍對大鼠胚胎冷凍獲得成功。此后,相關學者對大鼠胚胎冷凍保存進行了大量的研究, 取得了一定的研究成果。由最早的人工控制緩慢冷凍，到利用電子計算機控制的胚胎冷凍裝置進行簡便、快速的程序化冷凍，以及玻璃化冷凍。本文綜述了大鼠胚胎冷凍保存技術的研究進展。

1 冷凍保護劑

冷凍保護劑是指可以保護細胞在低溫或超低溫時產生損害(物理性、化學性)等的一類化合物。其作用機理為：冷凍保護劑可以與溶液中水分子結合或相互作用，從而降低冰點，減少冰晶形成，降低胚胎細胞外冰晶對細胞產生的損傷[3]。冷凍保護劑常與適宜的培養液配制成一定濃度的溶液，作為冷凍保護液。冷凍保護劑的分類：

1.1 低分子量滲透性冷凍保護劑

低分子量滲透性冷凍保護劑主要包括甘油(Gl ycer in)、二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙烯二醇(PG)、乙酰胺(Acetamide)、甲醇(Methanol)等。此類冷凍保護劑分子量小, 能滲透到細胞內，在細胞內外產生一定濃度差，降低細胞內外未結冰溶液中電解質濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷；同時細胞內水分不會過度外滲，避免細胞過分脫水皺縮。但它們對胚胎也有一定毒害作用，尤其在高濃度或高溫下毒害作用更大。選擇該類物質作為冷凍保護劑需優先考慮其細胞毒性，滲透性次之。此類保護劑在玻璃化冷凍中得到廣泛的應用。如乙二醇,形成玻璃化能力弱，但其毒性低、滲透性好，與形成玻璃化能力強的冷凍保護劑(DMSO等)組合，可組合成多種效果較好的玻璃化冷凍液。另外，冷凍劑對胚胎的滲透性及毒害作用不僅取決于冷凍劑本身的性質，還與胚胎所屬動物種屬及發育階段有關[4]。

1.2 低分子量非滲透性冷凍保護劑

低分子量非滲透性冷凍保護劑指某些糖類,例如單糖(葡萄糖、果糖、山梨醇和甘露醇)和一些二糖(蔗糖、海藻糖)，多糖(棉子糖)。目前應用最廣泛的是蔗糖。冷凍液中添加的糖類有兩大特性，一是既能提高滲透壓來促進細胞脫水，保持細胞結構的完整。在糖溶液中預平衡能夠使細胞脫出更多水分，減少胚胎與毒性大的滲透性冷凍保護劑接觸時間；二是減小達到玻璃化所需的滲透性冷凍保護劑的濃度。這兩個方面均可降低冷凍保護劑對胚胎的毒害作用。另外，糖類還可作為滲透壓緩沖物質，通過減少解凍時細胞的膨脹速率和程度減少滲透性損傷的發生。這類冷凍保護劑在低溫下對胚胎無毒害作用，但是溫度升高時卻對細胞有毒害作用[5]。多糖和二糖在室溫下不易溶解并且容易從溶液中析出，同時二糖需要較高濃度才能形成玻璃化狀態。

1.3 大分子物質

大分子冷凍保護劑主要有聚乙二醇(PG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚蔗糖(Ficol l)、羥乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch)、透明質酸鈉(Soduim Hyaluronate)、葡聚糖(Glucan)等聚合物。這類冷凍保護劑比滲透性冷凍保護劑毒性低，且有促進玻璃化作用, 能部分替代其他非滲透性冷凍保護劑，降低冷凍液的毒性。胚胎解凍時比冷凍時更易形成使細胞致死的冰晶，因此克服解凍時所形成的致死冰晶至關重要。據報道，許多大分子物質如聚乙二醇、聚蔗糖、透明質酸等都具有阻止解凍時形成冰晶的作用。目前該類冷凍保護劑的保護機制尚不完全清楚。史洪才[6]推測，大分子保護劑可以優先結合溶液中的水分子，從而降低溶液中自由水含量，減少冰晶的形成；使溶液中電解質濃度降低，從而減輕冷凍中溶質對細胞產生的損傷；復溫時使細胞外液的滲透壓變化較為穩定等。

2 常用冷凍方法及比較

2.1 常規慢速冷凍

常規慢速冷凍由Whi t t ingham等[7]首先發明，對小鼠胚胎冷凍保存獲得成功，解凍后移植產下后代。隨后，牛(Wilmut 和 Rowson，1973)、家兔(Whittingham 和 Adan-ls，1976)、大鼠(Whittingham，1975)、山羊(Bihon 等，1976)和綿羊(Wdhdsen 等，1976)等動物的胚胎超低溫保存也相繼取得成功。將胚胎依次放入一系列逐漸增加冷凍保護劑(如DMS0、丙三醇和乙二醇)濃度的溶液中梯度脫水，再利用程序冷凍儀或不同溫差的冰箱分階段降溫。Wi l ladsen[8]在此基礎上做了改進, 在降溫達到-35℃～-38℃后直接投入液氮中保存，將冷凍時間縮短到2 h之內。目前常規慢速冷凍在冷凍保護劑的選擇、添加方式、平衡時間、植冰溫度及降溫速率等環節已形成了一整套完整的技術流程，且被廣泛應用于畜牧業生產中，為大鼠胚胎冷凍的研究提供了可行的模式。

大鼠胚胎常規慢速冷凍的具體操作步驟如下：①室溫下將胚胎置于冷凍液中，5～10min,使胚胎和冷凍液間達到平衡; ②在 -5℃～-9℃進行人工植冰; ③以0.3℃～0.6℃/min的速率緩慢降溫; ④降溫到-30℃～-40℃，投入到-196℃的液氮中保存。

常規慢速冷凍法采用低濃度的冷凍保護劑，對胚胎毒害小，解凍后胚胎的存活率和移植成活率都較高；在儲存和運輸時，對于環境溫度的變化有更大的耐受力。但操作過程繁瑣，費時較長，需要人工植冰，又需要程序冷凍儀，實驗成本較高。

2.2 玻璃化冷凍

自1985年Ral l y等[9]用玻璃化溶液冷凍小鼠8-細胞胚胎獲得成功以來，經Schefen等[10]、Nakagata[11]、Kasai等[12]、Zhu等[13,14]、Szélld等[15]、Vincent等[16]、Saha[17]以及 Dobinsky等[18]研究者的不斷改進，玻璃化冷凍技術日趨成熟，并廣泛用于馬、兔、牛、山羊、豬等家畜不同階段胚胎的冷凍保存[19,20]。

這種方法采用快速降溫和高濃度的冷凍保護劑，使冷凍過程中溶液變得十分黏稠和堅固，不形成冰晶。快速降溫可以使玻璃化溶液中冷凍保護劑的濃度降低，降低冷凍保護劑對胚胎的毒害作用。為提高冷凍速率，研究人員發明了許多非常有創意的冷凍載體，其中最受歡迎的是由Vaj ta發明的OPS法[21]。OPS法是利用加熱將細管拉長拉細，使管壁變薄、細管頸部體積變小來提高冷凍速率，其冷凍速率可達20 000℃/min以上。采用該法冷凍胚胎可以防止冷凍損傷、降低冷凍保護劑對胚胎產生的毒性和滲透性損傷。但高濃度的冷凍保護劑會對胚胎產生毒害作用。因此尋找毒性低、形成玻璃化能力強的玻璃化冷凍液成為胚胎玻璃化冷凍研究的關鍵和熱點之一，也是大鼠胚胎冷凍的研究熱點。有關研究表明，把不同種類的冷凍保護劑組合成玻璃化冷凍液，能達到降低冷凍保護劑對胚胎毒害作用，提高玻璃化冷凍效果的目的。

玻璃化冷凍操作簡單，整個冷凍過程僅持續不過一兩分鐘，且不需要昂貴的儀器設備，有利于野外操作及大規模推廣應用。不利的因素主要是對實驗室工作人員的熟練操作程度要求極高。玻璃化冷凍的全部操作必須在規定的數分鐘或更短的時間內完成，否則高濃度的冷凍保護液會對胚胎造成一定的毒害作用，甚至致胚胎死亡。尋求對胚胎低毒或無毒的化合物，是玻璃化冷凍方法急需解決的問題。近年來對玻璃化胚胎冷凍研究趨向于在冷凍保護劑中添加其他物質，如糖類、抗凍蛋白、透明質酸、松弛素、鹽等，以提高冷凍效果和冷凍成功率[22]。

3 解凍方法

解凍方法對胚胎的存活和能否進一步發育有很大的影響。實驗證明，冷凍胚胎的快速解凍優于緩慢解凍。采用快速解凍，胚胎在0～40 s內由-196℃迅速上升至30～35℃, 瞬間通過危險溫區，使冰晶來不及形成。為了避免冷凍保護劑對胚胎產生毒害作用，解凍后需立即除去冷凍保護劑，通常用蔗糖溶液一步法或階梯法，分步將冷凍保護劑脫出。目前，蔗糖的濃度還沒有一致的共識，但常用0.25～0.5mol/mL的蔗糖作為梯度解凍液。

大鼠冷凍胚胎的解凍步驟：①胚胎冷凍管自液氮中取出后在室溫下的空氣內(20～28℃)停留10～15 s；②將含胚胎的冷凍管投入37℃，水浴10～30 s，輕輕搖動；③冷凍管內加入1mL預熱至37℃的0.25mol/mL蔗糖溶液，移入35mm或60mm培養皿中，立視顯微鏡下檢出形態良好的胚胎(或用含0.25mol/mL，0.5mol/mL蔗糖的PBS緩沖液分兩步)脫除冷凍保護劑并使胚胎復水；④移入培養液(大鼠體外受精液)觀察其復蘇發育情況；或在二氧化碳培養箱內，應用R2ECM大鼠早期胚胎發育培養液繼續培養；或準備移植。

4 研究現狀及應用前景

4.1 研究現狀

大鼠胚胎冷凍-解凍后的復蘇率和移植率是大鼠胚胎冷凍技術面臨的最主要問題。為此相關科學家針對低溫保護劑、冷凍方法、解凍方法等各方面開展了一系列的研究，并取得了一定的成果。

1975年Whit tingham等[2]首次利用二甲基亞砜(DMSO)作為冷凍保護劑，通過慢速冷凍對大鼠胚胎冷凍獲得成功。采用1.5mol/L、3mol/L的DMSO作為冷凍劑，對大鼠的2-細胞、4-細胞、8-細胞期胚胎進行冷凍，冷凍和解凍步驟與其在1972年成功冷凍小鼠8-細胞期胚胎相似，解凍后胚胎正常率也與小鼠相近。不同的是，解凍后不同階段的大鼠胚胎在進行體外培養時差異卻很大。例如：經冷凍-解凍后61%的8-細胞，培養48 h后能發育至囊胚；但僅有30%的2-細胞可發育至4-細胞。大鼠體外培養的胚胎在4-細胞期后產生發育阻滯，而不像小鼠那樣在體外培養時會產生2-細胞期發育阻滯。這一現象與Folstad[23]，Mayer[24]、Toyoda[25]等對大鼠2～8-細胞期的新鮮胚胎進行體外培養的結果相一致。冷凍-解凍后正常胚胎對代孕鼠進行移植，2-細胞期冷凍胚胎移植后約可獲得11%的新生仔鼠。

冷凍保護劑的改良使得復蘇后大鼠胚胎的發育能力大大提高。如1977年Miyamoto[26]等用乙二醇作為主要的冷凍劑，對大鼠2～8-細胞期胚胎進行冷凍，復蘇后64%的胚胎可發育至桑葚胚。1982年Kasai[27]等用甘油作為主要的冷凍劑，解凍后71%的胚胎能發育至桑葚胚。隨后大量的研究亦證明，在大鼠的胚胎冷凍中，以甘油作為冷凍劑的效果比乙二醇好。

1988年T Kono等[28]首次采用玻璃化冷凍法對大鼠囊胚進行冷凍獲得成功。以二甲基亞砜、乙酰胺、丙二醇及乙二醇組合液作為冷凍保護劑，胚胎在室溫下冷凍液預平衡后直接投入液氮中保存。解凍后79%(117/149)的胚胎形態正常，100% (48/48)的胚胎在體外培養能發育至擴張或孵出囊胚；假孕鼠移植獲得41%(28/69)的新生仔鼠。隨著玻璃化冷凍方法在馬、兔、牛、山羊、豬等家畜不同階段胚胎的冷凍保存中的廣泛應用，玻璃化冷凍方法在大鼠胚胎冷凍中的研究亦漸成熱點。

近10年來，國內外學者在大鼠胚胎冷凍技術上做了大量研究并取得了很大的進步。國內研究：如梁成光等[29]對大鼠囊胚進行常規慢速冷凍、玻璃化冷凍、OPS冷凍-解凍，用Whi t ten培養液在37.5℃、100%濕度和5%C02條件下進行發育培養，24 h后胚胎解凍存活率分別為82.4%、76.9%和85.7%；48 h后孵化率分別為47.1%、46.1%和53.6%。但是3種方法的存活率及孵化率均無顯著差異。徐平等[30]對5日齡大鼠胚胎進行了玻璃化冷凍方法和緩慢冷凍方法的比較研究，胚胎復蘇率分別為60.46%和64.29%。移植后受孕率分別為39.47%和42.56%。兩種方法的復活率和受孕率亦無顯著差異。2008年周生來等[31]選用1mol/L的DMSO和DAP213冷凍劑對大鼠2-細胞期胚胎進行兩步玻璃化凍存，平均復蘇率達85%～88.3%，產仔率達37.14%。

國外研究：如2003年Han等[32]選用EFS20和EFS40玻璃化冷凍液，利用兩步法對大鼠各階段(1-細胞、2-細胞、4-細胞、8-細胞等)胚胎進行凍存，復蘇率達到94%～100%，獲得了很好的凍存效果。2003年Isachenko等[33]對大鼠早期桑葚胚、早期囊胚、囊胚及擴張囊胚進行兩步法玻璃化冷凍，其復蘇率分別為81%、83%、34%和76%。研究發現該方法不適合囊胚期冷凍，適用于冷凍其它三個階段的胚胎。2009年 Sei ta等[34]采用玻璃化冷凍法對大鼠原核期胚胎進行冷凍獲得成功。室溫下，胚胎于冷凍液1(7.5%EG+7.5% DMSO+20% FCS)和冷凍液2(15% EG+15%DMSO+0.5mol/L Sucrose+20% FCS)中預平衡后直接投入液氮中進行保存。復蘇后胚胎獲得較高的存活率：82%～96.1%的胚胎能發育到2-細胞，36.5%～40.3%能發育至囊胚。

4.2 應用前景

在冷凍保護劑的研究中，一些生物活性物質漸成研究的熱點。這類用于冷凍保護的生物活性物質主要包括牛血清白蛋白(BSA)、抗凍蛋白(AFPs)和熱滯蛋白(THPs)等。血清是冷凍基礎液的成分之一, 能夠穩定胚胎細胞膜、阻止胚胎或卵母細胞透明帶在冷凍過程中硬化。抗凍蛋白(AFPs)是一類能在低溫條件下生存的生物體內發現的蛋白質，其不僅可非依數性地降低溶液冰點，對冷凍細胞和胚胎起高效的保護作用，還能與細胞膜作用，封閉離子通道，阻止溶質滲透，保護細胞膜的完整性。AFP和THP可與細胞膜相互作用，改善細胞膜的穩定性，在低溫下保護胚胎不受損傷[29]。熱滯蛋白(THPs)在高濃度下對細胞無毒性作用，其分子量大，不影響細胞的滲透壓，同時還可以溶解在緩沖液或玻璃化液中[35]。

AFPs自發現以來引起了許多學者的興趣，其結構和抗凍機理的研究更是被關注的熱點。近年來，越來越多的越冬昆蟲和植物被認為以生產抗凍蛋白作為其對低溫適應的策略。若抗凍蛋白能在大鼠胚胎冷凍技術中成功應用，則可能使胚胎冷凍保存上一個新臺階。

大鼠胚胎冷凍保存技術的研究雖取得了一定進展,但仍存在許多不足之處。如對冷凍保存的機理尚不完全清楚。尤其是在冷凍過程中對細胞超微結構(如膜結構、細胞骨架等)的損傷機理方面研究甚少；胚胎在體外培養的發育率和體內移植后的產仔率較低(37%～43%)[25,27]；冷凍保存過程中的技術環節仍有待于規范化和簡單化。為此,廣大科研工作者要在現有方法的基礎上，進一步探討冷凍保存過程中細胞損傷的機理；提高冷凍-復蘇率等低溫生物學領域遺留的難題。

感謝：中國醫學科學院醫學實驗動物研究所張連峰教授對本課題從經費和技術指導各方面給予的大量、慷慨的幫助，特此表示衷心感謝！

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