高效液相色譜-質譜聯用技術在藥物分析中的應用

唐學紅，肖先舉

（徐州工業職業技術學院， 江蘇 徐州 221140）

分析測試

高效液相色譜-質譜聯用技術在藥物分析中的應用

唐學紅，肖先舉

（徐州工業職業技術學院， 江蘇 徐州 221140）

介紹了近年來高效液相色譜-質譜接口技術的研究進展，綜述了該技術在中藥指紋圖譜研究、藥物代謝分析、藥物中非法添加化學藥物成分的鑒定分析、以及殘留藥物成分的鑒定分析方面的應用。隨著液質聯用技術的不斷完善、發展，其必將在藥物分析中發揮越來越重要的作用。

高效液相色譜-質譜聯用；接口技術；藥物分析

高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)聯用技術是將高效液相色譜與質譜串聯成為一個整機使用的檢測技術。該技術自20世紀70年代進行開創研究以來，經歷了長期的實踐和研究過程，直到90年代大氣壓電離技術成熟后，各種商品化儀器相繼問世，液-質聯用技術才得以迅速發展，成為科研和日常分析的有力工具。HPLC可以直接分離不揮發性化合物、極性化合物和大分子化合物（包括蛋白質、多肽、多糖和多聚物等）；MS靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，可得到更多的化合物的結構信息。HPLC-MS聯用技術結合HPLC的高分離能力和MS的強定性能力，在生物、藥物、臨床醫學、化工和環境等領域應用越來越廣泛。

本文就近年來 HPLC-MS聯用技術在中藥指紋圖譜研究、藥物代謝分析、藥物中非法添加化學藥物成分的鑒定分析、以及殘留藥物成分的鑒定分析4個方面的應用作一綜述。

1 HPLC-MS聯用接口技術

液質聯用儀是由HPLC、接口裝置及MS三大結構單元組成。由于MS的正常工作需要高真空環境，而常規HPLC分析在常溫常壓下就可進行。如果要實現高效液相色譜與質譜的聯用，HPLC與MS的連接，即接口技術是關鍵。理想的“接口”裝置必須能夠使來自HPLC的連續流動的液體迅速氣化，在保證MS高真空工作環境的前提下，去除流動相中的基質對質譜可能造成的污染，使待測樣品電離成帶電離子，然后進入質量分析器被分析。

在液質聯用接口技術發展過程中，出現了20多種接口，這些接口都有自己的開發、完善過程，都有自己的優點和缺點。采用過的接口主要有熱噴霧接口（TSP）、粒子束接口（LINIC）、快原子轟擊接口（FAB）、大氣壓離子化接口（API）等。大氣壓離子化接口（API）是當前應用最廣泛的接口技術，它是一種常壓電離技術，不需要真空，減少了許多設備，使用方便，近年來得到了迅速的發展。大氣壓電離的出現，成功地解決了在大氣壓條件下，使待測物質電離并有效的到達質譜進行分析，從而解決了接口問題，使液相色譜和質譜實現了真正的聯用。API主要包括三種操作模式：電噴霧離子化（ESI）、離子噴霧離子化（ISI）和大氣壓化學離子化（APCI）。這三種模式中樣品的離子化均是在大氣壓下的離子化室內完成，離子化效率高，穩定性好，靈敏度高[1]。

2 HPLC-MS技術在藥物分析中的應用

2.1 在中藥指紋圖譜研究的應用

中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖，它是一種綜合的，可量化的鑒定手段。中藥成分復雜，其中含有大量的次生代謝產物，因此分離提純難度大。目前中藥質量控制主要是對一些主要成分或特征性成分進行定性鑒別及含量測定，但大量研究表明，中藥的藥效是多成分共同作用的結果，而并非只是某幾個“指標成分”或“主要成分”在起作用[1]。中藥指紋圖譜技術可對中藥進行成分分析，為中藥質量控制的提供依據。液質聯用技術對樣品不需要進行繁瑣和復雜的前處理，可對已知成分進行定性定量分析，在對未知成分的研究中，質譜檢測器可以提供大量的結構信息，結合已知結構化合物的裂解規律，或結合其他方法，即可對未知成分進行定性或定量[2]。

李翔等[3]采用液相色譜-質譜聯用技術建立黃芪藥材高效液相-質譜檢測器(HPLC-MS)總離子流色譜指紋圖譜，結果表明黃芪藥材HPLC-MS總離子流色譜指紋圖譜具有較好的穩定性、精密度和重復性，相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于4.5%，標定13個共有峰，相似度計算結果均大于0.94。

段天璇等[4]測定甘草甲醇提取物的 HPLC-DAD及HPLC-MS指紋圖譜。結合文獻對指紋圖譜主要色譜峰進行鑒定，推斷出17個色譜峰中19個可能的成分，給甘草質量評價等各類研究提供較全面的化學依據。

秦澤慧等[5]建立了廣西產兩面針的液質聯用指紋圖譜檢測方法，為最終實現兩面針真偽品的鑒別奠定基礎。以Agilent Zorbax Eclipse C8（ 2.1 mm×100 mm，3.5μm）為分析用色譜柱，甲醇-乙腈-0.5%甲酸溶液（氨水調pH=4.5）為流動相，采用梯度洗脫，ESI（+）檢測，分析了 15 批廣西產兩面針藥材，并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統進行了相似度計算。結果建立了廣西產兩面針液質聯用指紋圖譜的共有模式，標定了指紋圖譜中的 22個共有峰，15 批藥材與共有模式的相似度大于0.90。結論此方法精密度、穩定性和重復性良好。

2.2 在研究藥物代謝中的應用

藥物代謝是研究藥物進入人體后，在體液、酶等的作用下進行的生化反應過程[6]。對藥物代謝的研究，包括藥物及其代謝物的分離、鑒定、體內體外代謝的比較、代謝途徑的追蹤、痕量分析測定。利用液質聯用技術，可以很好地分離純化鑒定代謝物樣品，并且能對以往難于辨識的痕量藥物代謝物進行鑒定及定量分析。

陳勇等[7]以苦參堿和氧化苦參堿為對象，對液相色譜-電噴霧離子阱質譜實驗條件進行優化，研究了氧化苦參堿在大鼠體內的主要代謝產物。健康大鼠腹腔肌注40 mg/kg氧化苦參堿，收集0～24 h的尿樣，尿樣中的代謝物經C18小柱進行富集與純化后，在選擇的最佳條件下進樣分析，結果表示，在大鼠尿樣中有原藥及其6種I相氧化及還原代謝產物，其中苦參堿為主要代謝產物，未檢出II相代謝物。

鄭國鋼等[8]用液質聯用法對人血漿中雷米普利及其活性代謝產物雷米普利拉的濃度進行了測定。以依那普利為內標，采用甲醇-0.1%甲酸溶液(75∶25)為流動相,以Waters Atlantis C18色譜柱為分析柱，通過電噴霧電離源(ESI)，以選擇離子反應監測(SRM)方式進行檢測。結果表明雷米普利和雷米普利拉分別在0.103～102.7 ng/mL和0.106～106.4 ng/mL濃度范圍內線性良好。最低檢測限分別為0.05 ng/mL和0.10 ng/mL(S/N=5)。該法專屬性強，樣品處理方便，靈敏度高，適用于雷米普利臨床藥物動力學研究。

晏利芝等[9]分析大鼠灌胃白花蛇舌草有效部位提取物后血漿中對香豆酸、反式6-0-對香豆酰雞屎藤苷甲酯及其代謝產物。取健康雄性SD大鼠按0.4 g/kg的劑量經口給予白花蛇舌草有效部位提取物，1.0 h后采集眼眶靜脈血液制備血漿，采用HPLC-Q-TOF-MS進行分析。結果在大鼠血漿中只檢測到1個代謝產物,并利用對照品鑒定了其結構為對香豆酸。本實驗為研究白花蛇舌草化學成分及藥效作用提供了理論依據。

2.3 在非法添加化學藥物成分鑒定分析中的應用

近幾年來，為了謀取暴利，一些不法分子在保健品或中成藥中非法添加化學藥物，對人們的身體健康造成了一定的危害。利用LC-MS技術的高靈敏度及多級質譜分析能力，可實現對中成藥及保健食品中非法添加成分的進行快速準確測定，成為各級檢查部門的重要檢測手段。

董宇等[10]建立了液相色譜-離子阱質譜聯用法檢測中藥降糖制劑中非法摻入苯乙雙胍和格列本脲專屬性方法，并對若干市售藥品進行檢測。選用Diamonsil C18柱，以乙腈-水-甲酸(體積比為 60.0∶40.0∶0.1)為流動相，對中藥降糖制劑的提取液進行液相色譜-離子阱質譜分析。結果在4種受試中藥降糖制劑中，2種被檢測到同時摻有苯乙雙胍和格列本脲，1種被檢測到摻有格列本脲。該方法選擇性強，靈敏度高，可作為分析檢測非法中藥降糖制劑的有效方法。

車寶泉等[11]采用HPLC-MS/MS方法鑒別中藥制劑及保健品中非法添加的10種減肥藥物。利用質譜解析軟件研究了上述化合物的質譜裂解規律，通過比較樣品峰與對照品峰的一級質譜、二級質譜質荷比，確定樣品中是否摻雜了化學藥物。結果表明各色譜峰間分離度良好，質譜分辨率符合要求，最小檢出量為2～100 ng。

2.4 在農藥、獸藥殘留檢測中的應用

食品及農產品中農藥、獸藥殘留含量甚微，往往需要進行痕量分析，對靈敏度、重現性與選擇性的要求非常高，需要在復雜的基質中檢測ppb級甚至更低濃度水平的痕量殘留物質。這就需要良好的樣品前處理手段來凈化復雜的食品及農產本底，濃縮目標組分，而且需要選擇高性能、高靈敏度的分析系統進行檢測分析[12]。液質聯用技術特別適合于痕量分析，可以鑒別和測定各種類型的農藥、獸藥以及生物毒素等殘留物，如動物組織(肌肉、脂肪、肝、腎)中磺胺類、硝基咪唑類、喹諾酮類藥物，水樣中的除草劑、殺蟲劑等。

趙華等[13]對動物性食品中的抗生素類藥物進行提取，再經HLB固相萃取柱凈化，采用電噴霧離子源，以正離子檢測方式進行質譜分析。實驗結果表明,在10～200μg/L質量濃度范圍內20種抗生素類藥物濃度與峰面積均呈線性,相關系數r>0.99，平均回收率為73.6%～114.6%，相對標準偏差為1.1%～12.0%(n=5)。

殷居易等[14]運用高效液相色譜-大氣壓電離串聯四極桿質譜(HPLC- APCI(+)MS/MS)內標法分析了蜂蜜、蜂王漿及凍干粉中甲硝唑、地美硝唑(二甲硝唑)、替硝唑、洛硝唑(羅硝唑)、特尼噠唑、異丙硝唑,以及羥基化甲硝咪唑、羥基化異丙硝唑、2-羥甲基-1-甲基化-5-硝咪唑9種硝基咪唑類藥物殘留量。蜂蜜和蜂王漿樣品的定量下限(LOQ，S/N>10)為0.5μg/kg，凍干粉樣品的LOQ為1.0μg/kg。在0.5～50.0μg/L范圍內,峰面積與質量濃度呈良好線性，r為0.993 2～0.999 5。

3 結 語

液-質聯用技術將色譜的高分離性能和質譜的高鑒別特點能力相結合，組成了較完美的現代分析技術。近年來，液-質聯用技術在應用方面取得了很大進展，國家標準委、美國FDA及歐盟等權威機構也該技術引入藥品食品質量監控中，液-質聯用技術由原先只是少數專家進行研究的手段發展成為一種常規應用技術。隨著現代化高新技術的不斷發展，液-質聯用技術將不斷完善，必將在藥物分析領域中發揮越來越重要的作用。

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Application of HPLC-MS in Pharmaceutical Analysis

TANG Xue-hong，XIAO Xian-ji
（Xuzhou Industrial Vocational and Technical Institute, Jiangsu Xuzhou 221140，China）

Research progress of HPLC-MS access technique was introduced, and application of HPLC-MS was summarized, such as study of traditional Chinese medicine fingerprint spectrum , drug metabolism analysis, analysis of illegal additive chemical drugs in medication and analysis of residual drugs. With the development of the HPLC-MS technology, HPLC-MS will play an increasingly important role in pharmaceutical analysis.

HPLC-MS; Access technique; Pharmaceutical analysis

TQ 460.72

A

1671-0460（2011）09-0988-03

2011-07-16

唐學紅（1979-），女，江蘇南通人，講師，碩士，研究方向：從事儀器分析方面教學和和科研工作。E-mail：txhxxj@126.com。