人體活檢穿刺組織、實驗動物組織熒光制片、HE制片中的技術改進

王曉鴻 孟曉軍 鄭燕璇 曹婉維

人體活檢穿刺組織、實驗動物組織熒光制片、HE制片中的技術改進

王曉鴻 孟曉軍 鄭燕璇 曹婉維

目的人體活體行肺、肝、腎穿刺及實驗用動物的肺、肝、腎組織制作免疫熒光切片、石蠟HE切片，用以明確疾病的性質以及做科研時動物試驗的組織進行科學病理分析。方法我院患者的活檢組織標本、試驗室的動物組織標本取1/4及1/3用普通膠水代替OCT包埋劑，冰凍機下行冰凍切片用以制作直接免疫熒光染色。剩余標本組織在脫水機改進時間后進行脫水處理，行石蠟包埋切片做HE染色。結果組織熒光制片效果好，無背景著色，切片完整，組織結構清晰。組織石蠟HE切片染色胞漿分明，切片完整。兩種制片鏡下觀察定位準確。結論采用改進后方法制片，節約資金，制片的陽性強度及陽性檢出率與未改進前相比效果好，定位準確。

活檢穿刺組織;實驗用動物組織;膠水包埋;冰凍切片;石蠟標本常規脫水處理的改進;直接免疫熒光染色;HE染色

隨著醫學科技的進步及科研方法的需要，在CT、B超引導下行肺、肝、腎穿刺，進行病理檢查，以明確疾病性質以及做科研時動物試驗的組織標本進行病理分析，這些都需要應用病理技術來處理以上各種組織進行直接免疫熒光染色及石蠟切片的HE染色等等。熒光染色、石蠟切片HE染色的質量直接影響到對患者診斷的判斷及科研工作的成敗。由于活檢肝、腎、肺穿刺組織及試驗用動物組織標本珍貴，組織小、質地稚嫩、柔軟、易碎等特點，如果按著常規標本的處理方法，往往容易造成組織過度收縮、脆裂、失去柔韌性，切片時呈碎渣樣，不能完整制片，甚至無法制片［1］。直接熒光免疫染色主要觀察各組織在某種疾病中的變態反應及其病因、發病機制，所以在標本中顯示的抗原或抗體是很關鍵的，我們使用冰凍切片行熒光抗體抗原染色。要制作優良的熒光切片，各環節都非常重要。首先冰凍制片中包埋劑的使用很關鍵，包埋劑包埋組織(-20℃ ～-25℃)冷凍后對組織起到支托固定的作用，常規制作冰凍切片使用的包埋劑是OCT，在多年的臨床工作中，我科使用普通膠水代替OCT包埋，所制冰凍切片用于熒光染色與使用OCT包埋劑所制熒光切片效果相同，現將摸索出的小組織制片方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 所有穿刺組織均為中山大學附屬第五醫院患者的穿刺組織、動物試驗動物組織為我院中心試驗室科研用動物;普通膠水;冰凍切片機(-20℃ ～-25℃);熒光抗體;PBS沖洗液;全封閉式脫水機;石蠟包埋前組織固定、脫水、透明、浸蠟用的各種試劑。

1.2 方法

1.2.1 制作直接免疫熒光染色［2］將組織置于冰凍機中用普通膠水包埋［3］，在-20℃ ～-25℃溫度中組織迅速凝凍固定。取下托架后置于冰凍機冷凍頭上(冷凍頭設定溫度為-15℃左右)，開始修切組織至合適時留片，切片要求盡量薄切，以利抗原抗體接觸和鏡檢。取出切片用吹風機冷風吹干固定，PBS沖洗3次，每次3分鐘，甩去PBS加熒光抗體30 ul，置于37℃溫箱孵育18～30 min取出，PBS沖洗3次，每次3分鐘，甩去PBS，緩沖甘油封片避光保存，熒光鏡下觀察。

1.2.2 熒光制片取材后剩余標本組織做HE染色［4］①標本立即置于中性緩沖甲醛固定液中固定，如果標本過小，可先點上伊紅用擦鏡紙包起來放進固定液中固定，可防組織丟失。固定液要保持新鮮，液量要求充足，固定時間為1～12 h;②脫水處理［5］:85%乙醇50 min→90%乙醇50 min→95%乙醇Ⅰ90 min→95%乙醇Ⅱ90 min→無水乙醇Ⅰ90 min→無水乙醇Ⅱ90 min;③二甲苯透明處理:二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ25 min;④浸蠟處理:石蠟Ⅰ120 min，石蠟Ⅱ50 min，石蠟Ⅲ90 min;⑤包埋;⑥切片、烤片、HE染色。

2 結果

用膠水包埋的組織作冰凍切片凝凍迅速，切片時質感均勻，切片完整，留片后膠水在玻片上容易用水洗凈，同時組織不易脫落，直接免疫熒光著色清晰，無背景著色，熒光陽性強度及陽性檢出率與用OCT包埋的冰凍制片著色的熒光切片相比較，效果無差異。同時進行石蠟制片的組織經過脫水處理改進后，制片可保證組織完整，最大限度保持了組織的結構，無碎裂，無過度收縮、變硬、變脆等現象，可制成3 um以下的超薄切片。鏡下觀察組織結構完整，細胞形態好，細胞染色鮮艷，核漿分明。各種染色均能準確表達，同常規處理的標本效果無異。

3 討論

固定液要求新配制的緩沖中性甲醛固定液，它對細嫩的組織固定時不會引起強烈的收縮，固定作用較溫和，對抗原保存較好，最大限度的保持了組織原有的結構，固定效果好，組織在做各種染色時易著色。脫水時各梯度酒精穿透力強，脫水速度快，對細嫩組織有明顯的收縮作用，應嚴格控制脫水時間。但是，脫水時間不夠，會造成因脫水不足致使二甲苯無法置換組織中殘留的水份，造成石蠟無法侵入，形成組織標本過軟，甚至自溶，無法切片。我們在試驗中還觀察到，即使脫水很好，二甲苯中透明和石蠟浸潤過程中，時間過長，也可使組織變硬、變脆，失去韌性，無法制片，影響鏡下判斷。通過試驗，把二甲苯透明總的時間控制為不超過40 min，石蠟浸潤總的時間不超過160 min，制出的切片為優質切片。制作熒光切片，免疫熒光中的標本組織的抗原鑒定和定位直接影響的結果判斷與對疾病的診斷，制片中力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和封埋過程中不發生溶解和變性，也不擴散至鄰近細胞或組織間隙中去。冰凍切片作熒光染色原理是用物理的方法低溫冰凍被包埋劑包埋的組織塊后再切片制片，包埋劑本身與組織不會有任何化學反應，包埋劑(膠水)不會破壞抗原的完整性，不會引起抗原發生溶解和變性、丟失。質量好的包埋劑凝凍時間短，切片時均勻，易切、易展、易用清水洗去殘留包埋劑。通過反復試驗，認為普通膠水代替OCT包埋來制作冰凍切片，用于直接免疫熒光染色效果與用OCT所制切片效果相同，且經濟實惠，為醫院降低了成本，也保證了質量。通過我科室臨床應用，改進后的組織脫水時間及對包埋劑的選擇的改進，效果好，值得向大家推廣。

［1］王曉鴻，林宇靜，等．腎臟穿刺活檢病理標本的制作與體會．中國實用醫藥，2009，4(29):195．

［2］王泊沄，等．腎活檢標本的制作技術．病理學技術，2000:948．

［3］王曉鴻，茍新敏，等．制作冰凍切片對包埋劑的選擇及應用．中國實用醫藥，2009，4(36):217．

［4］王曉鴻，肖佐環，等．肝腎肺穿刺組織及實驗用小白鼠組織石蠟制片的處理及改進方法．中國實用醫刊，2010，37(19):97．

［5］王泊沄，等．組織切片技術．病理學技術，2000:76．

519000 珠海，中山大學附屬第五醫院病理科