無抗性選擇標記轉基因技術在蔬菜作物上的應用

王 燁 顧興芳

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

隨著人們生活水平的提高，蔬菜、花卉類園藝作物在日常消費中的比重越來越大，人們對于園藝產(chǎn)品的要求也越來越高，但在短期內(nèi)傳統(tǒng)的育種手段很難有新的突破，研究人員期望通過更先進的技術如轉基因技術對育種材料進行創(chuàng)新和改良。但目前絕大多數(shù)蔬菜作物的轉基因研究尚停留在實驗室水平，還未真正走向市場。這不僅與轉化效率較低有關，更與轉基因作物的安全性相關。

1 采用無抗性選擇標記轉基因技術的意義

從 1983年獲得第一株轉基因煙草以來，植物轉基因技術已經(jīng)有了很大發(fā)展，所涉及的作物種類也越來越多。截止到2009年，有23個國家已經(jīng)批準基因改造作物的商業(yè)化種植，并且有29個國家允許基因改造作物進口或將其釋放到自然環(huán)境中去（Koreen et al.，2009）。隨著轉基因作物新品種的問世及其商品化的不斷擴大，人們對于轉基因技術在食品安全和生態(tài)環(huán)境安全的關注也日漸增多，并影響到其應用和商業(yè)化進程。目前所采用的轉基因技術一般采用抗性選擇標記（如抗生素類或除草劑類抗性基因等）對轉化植株進行篩選。篩選結束后選擇基因同目的基因一并整合到植物基因組中，其繼續(xù)表達的產(chǎn)物可能會對作物生長、生態(tài)環(huán)境甚至人類帶來一系列不安全因素。主要表現(xiàn)在對食品、藥品的安全影響。當抗性選擇標記基因是編碼一些動物腸道抗生素類的抗性物時，這些基因可能被轉移到微生物中去，這樣就增強了病原微生物的抗藥性，引發(fā)藥物的減效或失效。另一方面轉基因作物可能會影響到生態(tài)環(huán)境安全，如對抗除草劑基因的使用。如果發(fā)生以花粉為媒介的基因漂流，可能使某些雜草獲得對除草劑的抗性而成為無法殺死的“超級雜草”（Pavletich & Pabo，1991），然而目前還沒有關于標記基因漂移帶來危害的報道（Puchta，2003）。為了規(guī)避具有潛在危險的抗性標記基因可能引發(fā)的安全問題，研究者力圖避免使用抗性基因，最早是在馬鈴薯的轉化中采用致病性強的農(nóng)桿菌進行侵染，不采用標記基因而是對再生植株進行篩選，PCR檢測轉化率僅1 %～5 %。該方法的缺點是工作量大且陽性率低（de Vetten et al.，2003；Ahmand et al.，2008），優(yōu)點是轉化植株無需進行抗性標記基因的剔除（Goldbrough et al.，1993；張余洋 等，2004）?，F(xiàn)在更多研究者致力于采用安全選擇標記基因或者標記基因刪除法來改進轉基因技術?？傊?，培育無抗性選擇標記基因的轉基因植物是當前植物基因工程研究迫切需要解決的課題。

2 無抗性選擇標記轉基因技術

2.1 安全選擇標記基因的應用

在轉基因過程中利用安全選擇標記基因，利用這些基因編碼的蛋白使轉化細胞可以繼續(xù)生長，從而在代謝和生長過程中處于優(yōu)勢，非轉化細胞則會衰亡；或者是借助某個基因編碼蛋白的表達來改變植株原有的狀態(tài)，使轉化植株較容易被識別出來。

2.1.1 與糖代謝相關的基因 磷酸甘露糖異構酶基因（phospho mannoseisomerase gene，pmi）編碼的甘露糖磷酸異構酶可以催化 6-磷酸甘露糖轉化為 6-磷酸果糖。培養(yǎng)基中的甘露糖被植物吸收后，經(jīng)細胞內(nèi)的己糖激酶催化為 6-磷酸甘露糖，轉化有 pmi的細胞可以將 6-磷酸甘露糖轉化為6-磷酸果糖，繼而為植物利用，在轉化過程中累計的ATP也可以為細胞生長提供能量（Weisser et al.，1996）。pmi是個源于植物自身的基因，且甘露糖更是作為甜味劑在食品加工業(yè)中廣為應用，是目前發(fā)展較完善的一個安全標記。Joersbo等（1998）早在甜菜上嘗試以甘露糖為選擇壓，效率比以Kam為選擇標記高1倍。

在紅色鏈霉菌（Haldrup et al.，1998a）和高溫厭氧芽孢桿菌（Haldrup et al.，1998b）中都有一個木糖異構酶基因（xylose isomerase gene，xylA），編碼木糖異構酶，催化D-木糖和D-木酮糖之間發(fā)生互變異構。很多植物無法利用D-木糖，因此在含有D-木糖的選擇培養(yǎng)基上，轉化xylA的細胞可以將D-木糖轉化為可利用的D-木酮糖，而那些非轉化細胞則會因為缺乏碳源而生長受到抑制。該選擇基因較早被應用到馬鈴薯上，用xylA作為選擇標記基因的轉化頻率是用Kam選擇的10倍（Haldrup et al.，1998a），且木糖是人類食品加工業(yè)中常用的添加劑，因此用木糖作為轉化選擇標記是安全的（Jaiwal et al.，2002）。

一般的植物細胞不能利用核糖醇為碳源，但大腸桿菌 C菌株可以在兩個緊密串聯(lián)的操縱子atl/rtl的協(xié)助下在以核糖醇為碳源的培養(yǎng)基上生長，因為它們編碼的蛋白酶分解代謝核糖醇，以其為選擇標記在培養(yǎng)基中添加核糖醇就可以篩選出轉化植株（Lafayette et al.，2001）。Reiner等（1975）把atl/rtl從C菌株分別轉化到K-12菌株和B菌株中后，兩個菌株都可以在以核糖醇為碳源的培養(yǎng)基上繼續(xù)正常生長（Reiner et al.，1975）。但目前未見在植物上成功利用的報道。此外，2-脫氧葡萄糖-6-磷酸鹽磷酸酯酶基因（DOGR1）（Kunze et al.，2001）和阿拉伯脫氫酶基因（atlD）（Lafayette et al.，2005）也屬于糖類相關選擇基因，但對其應用不多。

2.1.2 與激素相關的基因 植物基因組內(nèi)有很多調(diào)節(jié)激素代謝的相關基因，這些來源于植物自身的基因同樣可以作為轉基因的選擇標記基因，而且非常安全。GUS基因來源于大腸桿菌，編碼β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）。GUS常作為報告基因，但Joersbo和Okkels（1996）利用GUS為選擇標記基因對植物細胞進行篩選，效率是用Kam選擇的2.9倍。Okkels等（1997）發(fā)現(xiàn)其原理是轉化細胞中的GUS基因可以作用于選擇培養(yǎng)基中添加的葡萄糖苷酸，從而釋放出有活性的細胞分裂素來促進細胞的分化、生長，而未轉化細胞則會分化受阻。

ipt主要源于農(nóng)桿菌 T-DNA，其編碼的異戊稀基轉移酶可以催化細胞分裂素合成的第一步，而細胞分裂素可以促進芽點分化。利用這個標記獲得的轉化植株由于激素代謝相關酶的超量表達使細胞分裂素的水平提高，植株的生長點失去頂端優(yōu)勢，表現(xiàn)出葉片卷曲、節(jié)間縮短，以此來鑒別轉化植株，但最后必須再利用轉座子元件（Ebinuma et al.，1997）或重組酶（Sugita et al.，1999）來刪除ipt。這一方法已經(jīng)在煙草（Ebinuma et al.，1997；Kunkel et al.，1999；Sugita et al.，2000）上獲得驗證。此外，源于根癌農(nóng)桿菌NIAES1724的rolA、rolB和rolC也可通過提高生長素活性來誘導“發(fā)狀根”，以此作為選擇標記（薛健 等，2008）。

吲哚-3-乙酰胺水解酶基因IaaH可以編碼調(diào)節(jié)植物吲哚乙酸代謝過程中的關鍵酶，使轉化細胞和非轉化細胞在激素代謝上造成差異（Ebinuma & Komanine，2001），從而達到選擇的目的，但對其在植物遺傳轉化中的應用卻較少報道。

2.1.3 與氨基酸代謝相關的基因 高等植物中賴氨酸是通過天冬氨酸途徑合成的，同時伴隨異亮氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸的合成。此合成途徑的關鍵酶是天冬氨酸激酶（AK）和二氫吡啶羧酸合成酶（DHDPS），AK受賴氨酸和蘇氨酸的抑制，而DHDPS則嚴格受賴氨酸的反饋調(diào)控（Mills et al.，1980）。但在細菌的賴氨酸合成途徑中，AK和 DHDPS對賴氨酸的反饋調(diào)節(jié)不敏感。因此在賴氨酸和蘇氨酸的選擇培養(yǎng)基上轉化了ak的再生植株可以保持較高水平的AK活性，保證了生長需要的氨基酸，而非轉化細胞則因為氨基酸合成途徑受阻而死亡（Jaiwal et al.，2002）。Perl等（1993）克隆了大腸桿菌中對賴氨酸反饋抑制不敏感的lysC，將其轉化馬鈴薯。Brinch-Pedersen等（1999）也用賴氨酸和蘇氨酸為選擇壓，研究轉化大麥，但出現(xiàn)較多白化苗。與氨基酸代謝相關的基因作為標記的還有鄰氨基苯甲酸合成酶基因ASAL（Makiko et al.，2005）和乙酰乳酸合成酶基因mALS（Tougou et al.，2009），但都沒有應用到蔬菜作物上。

2.1.4 其他安全選擇標記基因 從維多利亞水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離出的綠色熒光蛋白基因（GFP）不僅可以在原核生物細胞中表達，還可以在真核生物細胞中表達，而且不會影響轉化細胞的正常生長和功能，其優(yōu)勢還在于不需要添加任何輔助因子而只需對其外觀進行熒光檢測就可以加以辨別（Stuber et al.，1998）。GFP在植物遺傳轉化中常作為報告基因，但目前越來越多的研究將其作為選擇標記基因，并已經(jīng)應用在煙草（朱生偉 等，2003）、水稻（Chung et al.，2000）、甜菜（Zhang et al.，2001）和甘薯（Lawton et al.，2000）等作物的遺傳轉化上。

甜菜堿脫氫酶基因BADH也常作為一個安全選擇標記應用到植物遺傳轉化中。BADH源于藜科高等植物，其編碼的蛋白可以催化有毒的甜菜堿醛轉化為無毒的甜菜堿，即在選擇培養(yǎng)基中添加甜菜堿醛作為選擇壓就能篩選出轉化植株。Danielle等（2001）以BADH作為選擇標記轉化煙草葉綠體基因組，轉化效率是用壯觀霉素選擇的25倍。

甜椒類鐵氧還蛋白基因PFLP曾用于蘭花的遺傳轉化。You等（2003）將PFLP的cDNA構建在CaMV35S啟動子下，對蘭花進行基因槍和農(nóng)桿菌轉化，以對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抗性為標記，最終獲得了轉基因蘭花植株。

谷氨酸-1-半醛-轉氨酶基因hemL編碼谷氨酸-1-半醛轉氨酶，其活性會影響葉綠素的合成。在選擇培養(yǎng)基中添加3-氨基-2，3-二氫苯甲酸就能抑制谷氨酸-1-半醛轉氨酶的活性，就無法正常形成葉綠素（Allison et al.，1997）。從Synechococcus PCC6301中分離得到抗3-氨基-2，3-二氫苯甲酸突變體GR6，其編碼基因hemL 在第5、6、7位發(fā)生絲氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸的刪除，248位蛋氨酸取代異亮氨酸。將此基因轉化植物可以提高細胞對3-氨基-2，3-二氫苯甲酸的抗性。整合有hemL的轉化植株可以在含3-氨基-2，3-二氫苯甲酸的培養(yǎng)基上保持綠色，非轉化植株則會白化（Gough et al.，2001）。

OsDREB2A和SOS1是分別從水稻和擬南芥中發(fā)現(xiàn)的兩個抗鹽基因。Zhu和Wu（2008）分別以這兩個基因作為選擇標記，構建載體 pZWOsDREB2A-cyc和 pZWAtSOS1-cyc，在含 200 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上對水稻進行轉化并篩選。通過鹽篩選系統(tǒng)的選擇很安全，不僅能獲得轉基因植株，還可以獲得耐鹽脅迫的新材料。

2.2 標記基因刪除法

該方法主要是利用常規(guī)的抗性選擇標記篩選出轉基因植株，然后通過轉基因后代遺傳重組使選擇標記和目的基因分離，或者是利用位點特異性酶將選擇基因剔除而獲得無抗性選擇標記的轉基因植株。常見有共轉化、轉座子、同源重組和位點特異性重組。該方法尚處于開發(fā)階段，試驗對象也僅是煙草、擬南芥等模式植物。

2.2.1 共轉化 共轉化是將標記基因和目的基因分別構建在不同的載體上或者同一載體的不同T-DNA區(qū)域內(nèi)，共同轉化受體細胞后通過分子鑒定獲得共整合植株，后代經(jīng)遺傳重組使標記基因和目的基因分離，并選擇只含有目的基因的轉化植株。共轉化需要后代遺傳分離來剔除標記基因，因而適合有性繁殖的植物，但DNA直接轉移獲得T-DNA容易緊密連鎖（Ebinuma et al.，2001b），后代分離也較難獲得標記基因分離的植株。具體有 3種途徑：① 用雙菌株轉化，每個菌株含有一個不同的質(zhì)粒。de Neve等（1997）將分別含有NPTⅡ和hpt的兩個根癌農(nóng)桿菌菌株混合后侵染擬南芥，其中southern-blot驗證有44.4 %的轉化植株有T-DNA連鎖，證明了這一途徑的可行性。Mc Knight等（1987）在煙草的轉化中也采用了兩個分別帶有不同基因的農(nóng)桿菌菌株。② 用單菌株轉化，菌株含有2個不同的質(zhì)粒。這種方法較容易分離獲得只含目的基因的轉化植株，但因為1個菌株內(nèi)含有不同質(zhì)粒容易引發(fā)質(zhì)粒的不相容性，因此要注意質(zhì)粒的選擇問題（Daley et al.，1998）。③ 雙 T-DNA法，即將2個基因整合到同一個質(zhì)粒上，這一方法較混合菌株的方法轉化效率高。Komari等（1996）將標記基因NPTⅡ或hpt分別和目的基因GUS構建在雙元質(zhì)粒載體的2個相鄰T-DNA區(qū)域上，對水稻進行侵染，共轉化率為47 %。分離后代中有65 %含有GUS，說明至少一半以上的共轉化植株中雙T-DNA的整合位點不連鎖。Lu等（2001）改進了質(zhì)粒的構建方法，把2個獨立的T-DNA序列改建為含雙右邊界的T-DNA和一個左邊界的T-DNA序列，用來轉化水稻。

2.2.2 轉座子 在玉米中首先發(fā)現(xiàn)的轉座子也可以實現(xiàn)基因重組，如玉米的Ac/Ds轉座原件，Ac主要是編碼轉座酶用于Ac和Ds基因的轉座，Ds兩端各有一個長度為數(shù)百個核苷酸的序列，中間可以插入較大的基因片段，且插入其他基因片段后的 Ds仍然可以同 Ac一起被轉座酶轉移（Fedoroff，1989）。基于這些特性，可以把目的基因置于轉座子的外部同時將標記基因插入 Ds內(nèi)部，轉化植物后選擇標記可以通過轉座作用被轉走，而轉化后代經(jīng)過遺傳分離可以獲得無標記的轉化植株；也可以將目的基因插入 Ds內(nèi)部，轉座酶把目的基因轉到染色體組的新位置上后再通過遺傳分離獲得無標記的轉化植株。轉座子法已經(jīng)應用到了煙草、番茄和水稻上，并獲得了無標記的轉基因植株（Goldbrough et al.，1993；Sugita et al.，1999；Cotsaftis et al.，2002；金維正 等，2003）。其缺點是轉座后基因還會重新插入，后代經(jīng)過有性分離才能獲得無標記植株，因此效率低，且工作量大、周期長，較適宜有性繁殖且生長周期短的植物。

2.2.3 同源重組 同源重組發(fā)生在DNA同源序列之間，指同源序列通過鏈置換和單鏈侵入形成異源雙鏈，通過一些重組酶修復可使兩條異源雙鏈發(fā)生交換。將其引入遺傳轉化，即在用農(nóng)桿菌轉化獲得選擇標記的轉基因植株后再設計一段同源序列，將標記基因置于2個同源序列之間，通過DNA重組將含有標記基因的DNA序列剔除。Fischer等（1996）曾用此方法轉化煙草的葉綠體染色體組，最終獲得了無標記基因轉化植株。同源重組轉化法不需要輔助因子參與，也無需后代的遺傳分離過程，但在植物的真核基因組中的重組效率較低，報道甚少。

2.2.4 位點特異性重組 位點特異性重組是指通過重組酶在DNA特異位點間實現(xiàn)交換，需要重組酶和其識別位點。應用在轉基因技術中，是在標記基因的兩端分別插入重組酶的識別序列，在重組酶的作用下將標記基因刪除。常見的重組系統(tǒng)有Cre/LoxP、FLP/FRT、R/Rs、Gin/gix和attP。

2.2.4.1 Cre/LoxP系統(tǒng) Cre/LoxP系統(tǒng)是Sterberg在大腸桿菌噬菌體P1中發(fā)現(xiàn)的，由重組酶Cre和識別位點LoxP組成。Cre可以識別34 bp的部分回文的LoxP序列，無需能量和其他蛋白便可以在體內(nèi)外對線性和環(huán)狀甚至超螺旋結構的DNA分子進行重組（Ow & Medberry，1995）。重組酶可以通過二次基因轉化將重組酶導入轉基因植株，也可以通過與含有重組酶基因的植株雜交導入，在切除標記基因后，通過轉化植株后代的分離將重組酶基因剔除，從而獲得無標記基因的轉基因植株。比較理想的是誘導表達系統(tǒng)與位點特異性重組系統(tǒng)相結合，將目的基因、標記基因和重組酶基因及其識別序列構建在一個載體上，誘導型啟動子在目的基因引入后瞬間表達重組酶基因，刪除標記基因和重組酶基因（Zuo et al.，2001）。Zuo等（2000，2001）構建了一個化學誘導表達的位點轉移DNA刪除系統(tǒng)PX6-GFP，培養(yǎng)基中的β-雌二醇誘導XVE表達，啟動Cre重組酶基因表達將識別序列間的選擇標記基因刪除。Hoff利用Cre/LoxP構建了pCrox載體，利用熱激啟動子HSP81-1啟動Cre，以GUS為報告基因（Hoff et al.，2001）。高尚等（2007）構建了NPTⅡ基因可被刪除的和可插入目的基因的通用植物表達載體pBI121-lox-MCS。這些表達載體可廣泛用于培育無選擇標記的轉基因植物。

2.2.4.2 FLP/FRT系統(tǒng) 釀酒酵母2μ的環(huán)狀質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的 FLP特異性位點重組酶是首先被用于切除轉基因植物中的標記基因的，因此 FLP/FRT是最早創(chuàng)建的位點特異性重組系統(tǒng)。Cregg和Madden（1989）克隆了酵母的FRTs之間的Arg，將FRTs-ARG+-FRTs結構導入Arg-酵母中，篩選得到了Arg+轉化植株。而后二次導入FLP重組酶，又獲得了Arg-的轉化子，證明發(fā)生了重組。后來Lyznik等（1993）又將該系統(tǒng)應用于玉米和水稻的原生質(zhì)體轉化。單曉昳等（2006）利用多步重組，構建了可在植物中廣泛應用的FLP/FTR位點特異性重組系統(tǒng)，經(jīng)過熱激處理后41 %的二次轉化植株發(fā)生了標記基因的刪除。目前所報道的植物轉基因研究中對該系統(tǒng)利用時均采用了二次轉化。

2.2.4.3 R/Rs系統(tǒng) 在結合酵母的環(huán)形質(zhì)粒pSR1中發(fā)現(xiàn)了這一系統(tǒng)（Sugita et al.，1999），包括重組酶R和2個重組酶識別位點Rs，在重組酶R的作用下識別位點Rs間發(fā)生同源重組（Reiner，1975）。Onouchi等（1995）利用含有R重組酶基因的轉化植株與位于Rs位點間的插入標記基因的植株進行雜交，獲得了無選擇標記的擬南芥。Sugita等（2000）把誘導表達系統(tǒng)和MAT載體結合，將R基因構建在除草劑“safener”誘導表達的啟動子之后，兩側有重復序列Rs，獲得了14 %含有GUS的無選擇標記植株，其中多數(shù)為單拷貝整合。

2.2.4.4 Gin/gix系統(tǒng)和attP系統(tǒng) Gin/gix系統(tǒng)是在Mu噬菌體中被發(fā)現(xiàn)的，在重組酶Gin的作用下，兩個特異性識別位點gix間的DNA片段發(fā)生剔除（Maeser & Kahmann，1991）。attP系統(tǒng)則是利用了噬菌體能通過噬菌體附著位點（attP）整合到大腸桿菌基因組的細菌附著位點（attP）上的原理。Zubko等（2000）發(fā)現(xiàn)在噬菌體的2個attP位點之間發(fā)生了染色體內(nèi)同源重組而將標記基因剔除，且不含INT和IHF蛋白的轉化體系。這兩個系統(tǒng)尚處于待開發(fā)和利用的階段，雖然在噬菌體上得以證實但在高等植物的遺傳轉化中缺少應用。

3 無抗性選擇標記轉基因技術在蔬菜作物上的應用

無抗性選擇標記轉基因技術是目前轉基因技術的前沿，在糧食作物和經(jīng)濟作物上已經(jīng)展開較深入的研究，但在轉基因技術相對薄弱的園藝作物上應用卻非常有限。

與糖類相關的選擇基因中利用pmi作為選擇標記的研究較多。彭世清和陳守才（2005）在番茄的遺傳轉化中嘗試建立甘露糖陽性選擇系統(tǒng)，構建了pmi為選擇標記的植物表達質(zhì)粒載體pPMI并導入農(nóng)桿菌EHA105中，研究甘露糖對番茄生長和生根的影響及葉盤對甘露糖的敏感性。通過農(nóng)桿菌介導番茄，獲得了轉化的再生植株，表明以甘露糖為陽性選擇系統(tǒng)在番茄遺傳轉化中的應用是可行的。王達新（2007）以黃燈籠椒為材料，建立高效的離體再生體系，利用 pBI121和pNOV2819及CMVcp基因構建了以pmi為選擇標記的pNOVcp植物表達載體，并通過其對甘露糖的抗性選擇試驗建立起甘露糖陽性篩選遺傳轉化體系。同年，Min等（2007）將pmi作為選擇標記基因，試圖將GLO和JMT兩基因轉入大白菜，通過在培養(yǎng)基中添加7 g·L-1的甘露糖和2 %的蔗糖對再生植株進行篩選，初步建立了甘露糖陽性選擇系統(tǒng)，兩基因的轉化率分別為 1.4 %和3.0 %，從而為大白菜轉基因研究提供了一條新的途徑。王洪偉（2009）曾通過攜帶含有pmi質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404侵染番茄子葉外植體，利用甘露糖篩選系統(tǒng)進行篩選，共獲得了54株再生植株，PCR初步證明獲得了陽性轉scFv植株。張海（2009）通過建立含pmi選擇標記的pCAOxOPMI表達載體導入甘藍型油菜，共獲得甘露糖抗性植株14株，PCR檢測其中11株為陽性。對木糖異構酶基因的利用，Haldrup等（1998b）曾將xylA作為選擇標記的木糖篩選體系應用到番茄的遺傳轉化中，較理想的篩選濃度是15 g·L-1的D-木糖，并獲得了初步成功，轉化率可以達到9%，而用Kam選擇的轉化率僅有7 %。崔麗巍（2010）以大腸桿菌xylA作為選擇標記基因，利用木糖作為選擇劑獲得能夠表達帶有GUS報告基因的轉基因黃瓜。同時構建了pX390-scFv載體，以木糖作為篩選劑進行黃瓜遺傳轉化研究，初步建立了農(nóng)桿菌介導的基于木糖選擇系統(tǒng)的黃瓜轉化體系。

以植物激素相關基因 ipt為選擇標記在園藝作物的遺傳轉化上也有成功的報道。Kunkel等（1999）利用地塞米松（dexamethasone）誘導的啟動子使 ipt表達，在誘導條件下獲得了萵苣的轉化植株。Thirukkumaran等（2009）也將該法用于長壽花的遺傳轉化，通過PCR驗證超過90 %的正常芽為ipt和GUS陰性，這些結果表明ipt引起的叢生芽現(xiàn)象可以將非轉化苗明確區(qū)分。

在刪除選擇標記策略中，共轉化法在園藝作物上的研究較多。Goldbrough等（1993）利用轉座子法把標記基因GUS作為報告基因插入Ds內(nèi)部，通過轉化后代的遺傳分離最終獲得了無標記基因的轉基因番茄植株。張余洋（2006）將位點特異性重組Cre/LoxP化學誘導系統(tǒng)應用到番茄的遺傳轉化研究中，p35G植物載體轉化番茄后共得到19個抗性芽，經(jīng)過β-雌二醇誘導后有2個無抗性標記的再生芽可以觀測到綠色熒光蛋白的表達，證明該誘導自主剔除系統(tǒng)適用于番茄。

4 小結與展望

目前，研究人員致力于各種安全標記開發(fā)和無選擇標記的轉基因技術的研究，主要是為了降低或克服轉基因植物的安全性問題，避免轉基因植物可能給自然環(huán)境帶來的負面影響，同時減少社會對于轉基因產(chǎn)品的顧慮，為其商業(yè)化鋪平道路。盡管這些新方法有著各種各樣的優(yōu)勢和缺陷，但都證明轉基因技術在日益完善。新技術已經(jīng)在很大程度上解決了傳統(tǒng)方法利用抗性選擇標記對生態(tài)環(huán)境和食品、藥物安全方面影響的問題，更省去了對抗性標記的安全性評估的過程。上述無抗性標記轉基因技術中，pmi、xylA和gpf等安全標記已經(jīng)廣為應用到植物的遺傳轉化研究中；共轉化法則是目前研究較深入且適用面較廣的無抗性標記轉基因方法；位點特異性重組法雖然現(xiàn)在尚處于研發(fā)階段，但將來應該是轉基因技術的重要發(fā)展方向之一。盡管這些新方法的研究已取得了一些成果，但只是在擬南芥、煙草和馬鈴薯上獲得了較大的進展，其他植物尤其是轉化效率較低的作物首先需要提高轉化效率。

轉基因技術的研發(fā)及其商業(yè)化在糧食作物和經(jīng)濟作物上已經(jīng)取得了一些成果和進展，例如水稻、玉米、大豆和煙草。但在蔬菜作物上受到的阻力較大，科研方面取得的研究進展就更少。為了發(fā)揮轉基因技術的優(yōu)勢，規(guī)避缺陷，發(fā)展出效率更高、更安全、更易操作的轉化方法，培育無抗性選擇標記的轉基因植物將是轉基因領域發(fā)展的必然趨勢。

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