健脾消癌方對結腸癌HCT116細胞遷移、侵襲的影響研究*

簡小蘭，曾普華，杜佳，何鳳姣，李克雄，蔣益蘭

1.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南長沙410006；2.中醫腫瘤學湖南省重點實驗室，湖南長沙410006；3.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208

結直腸癌（Colorectal cancer）在全球的發病率及死亡率均處于第3位。近年來隨著醫療技術的發展，在早期診斷方面有所進展，仍有1/3的患者在確診時已發現轉移［1-2］，5年總體生存率低于50%［3］。引起結直腸癌患者死亡的主要原因——侵襲及轉移［4-5］，積極探索復發轉移機制并進行阻斷是提高結直腸癌患者生存率的關鍵。大量的臨床研究均顯示中醫藥在結直腸癌的綜合治療中發揮重要作用［6-8］。中醫藥具有抗腫瘤、抗復發轉移、調節免疫力、提高生活質量、延長生存期等作用。多年的臨證研究證實，健脾消癌方抗結直腸癌術后復發轉移具有良好療效［9-12］，但其機制尚未完全闡明。本研究從癌細胞遷移、侵襲力方面，運用血清藥理學方法研究健脾消癌方對結腸癌細胞遷移及侵襲作用的影響，進一步探討健脾消癌方抗復發轉移療效機制，為臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 動物和細胞株SD大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體質量（200±20）g，雌雄各半，合格證號:SYXK（湘）2015-008。人結腸癌細胞株HCT116購買于中國科學院細胞庫，編號TCHu 99。

1.2 藥物健脾消癌方主要藥物是人參10 g，薏苡仁30 g，重樓10 g，半枝蓮30 g，郁金15 g，莪術10 g，從湖南省中醫藥研究院附屬醫院中藥房購買。取上述2倍量藥物，用水浸泡1 h，水量超出藥物3～5 cm，大火煮沸后轉小火煎30 min，過濾，藥渣按前法再煎煮2次，將3次藥液混勻、過濾，減壓濃縮為相當于生藥1.5 g·mL-1，4℃保存，1周內用完。

1.3 試劑與儀器胎牛血清（以色列Biological industries公司，批號:1616316）；DMEM培養基（美國Hyclone公司，批號:NZD1131）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號:P0012）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號:P0013b）；結晶紫（上海碧云天生物技術有限公司，批號:C0121）；MMP-2（美國Abcam公司，貨號:ab92536）；MMP-9（美國Abcam公司，貨號:ab228402）；β-actin（美國Abcam 公司，貨號:ab6276）；山羊抗兔IgG（康為世紀生物科技有限公司，貨號:01325）；山羊抗小鼠IgG（康為世紀生物科技有限公司，貨號:50237）。

細胞培養箱（美國Thermo公司）；Hoefer電泳（美國Hoefer公司）；凝膠成像系統（美國Syngene公司）；EIX808U型全自動酶標儀（美國BioTek公司）。

2 方法

2.1 含藥血清的制備SD大鼠20只，雌雄各半，隨機分成2組，每組10只。實驗組按10.8 g·kg-1（相當于70 kg成年人120 g·d-1的等效量）灌胃；對照組以等容積的生理鹽水灌胃。每天灌胃1次，連續7 d，第7天灌胃1 h后，10%水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔麻醉，腹主動脈采血，血液4℃保存，24 h內離心，收集合并同組動物血清，微孔濾膜（0.22μm）過濾除菌，保存于-20℃冰箱。

2.2 細胞培養HCT116細胞培養于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養液中，置于37℃，5%的CO2細胞培養箱中培養。細胞長滿培養皿底約90%時，進行細胞傳代，更換培養液，傳代比率為1∶2或1∶3。需要進行實驗處理時，取匯合率為80%的對數期細胞。

2.3 細胞劃痕實驗取對數生長期HCT116細胞，調整細胞密度為5×105mL-1，按每孔2 mL接種于6孔板中，待細胞長滿后，吸棄培養液，將一張事先畫有直線的紙放于6孔板下，各直線間隔適中，用100μL槍頭沿直線劃痕，每孔3條，PBS沿壁輕輕沖洗細胞3遍，吸棄PBS，分別加入濃度為10%、15%、20%的含藥血清培養液2 mL，10%、15%、20%的鼠對照血清培養液2 mL，及10%胎牛血清為陰性對照組，每組設置3個復孔，培養24 h、48 h后取出培養板，有脫落細胞影響觀察則予以更換培養液，倒置顯微鏡（×50）任意選取5個不同視野拍照，測量劃痕的距離。

2.4 Transwell檢測細胞遷移、侵襲能力侵襲實驗選用Transwell小室（孔徑8μm），首先制備含Matrigel膠的Transwell小室。取對數期生長HCT116細胞，調整細胞密度為5×105mL-1，接種于6孔板，分別以10%、15%、20%含藥血清和10%、15%、20%鼠對照血清，10%胎牛血清處理細胞。24 h后收集細胞，用DMEM高糖培養基重懸細胞均調整密度為2×106mL-1，分別取100μL各組細胞懸液加入Transwell小室上室，24孔板下室加入600μL含15%的胎牛血清（FBS）培養液。培養24 h后，取出小室清洗，4%的多聚甲醇固定15 min，晾干10 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS清洗3遍，33%的醋酸將Transwell膜上細胞洗滌下來，酶標儀570 nm波長讀取OD值，計算細胞遷移抑制率。遷移實驗除不在小室鋪膠外，其余步驟同侵襲實驗。

遷移抑制率＝［（胎牛血清對照組平均吸光值-實驗組平均吸光值）/胎牛血清對照組平均吸光值］×100%

2.5 Western Blot法檢測基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）蛋白的表達以15%的有效濃度處理細胞，15%鼠血清對照組、10%的FBS為陰性對照組，干預48 h，收集細胞，預冷PBS洗細胞3次，加入含有4μL的含PMSF的RIPA緩沖液400μL，冰上裂解30 min，4℃、12 000 g離心15 min，取上清，BCA試劑盒進行蛋白定量，按照比例加入SDS-PAGE蛋白緩沖液，煮沸5 min，立即分裝，置-80℃備用。取50μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜至PVDF膜，封閉，一抗室溫孵育4 h、二抗室溫孵育2 h，ECL發光，分別檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平，β-actin為內參。以Image J軟件分析結果。

2.6 數據統計統計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 健脾消癌方對細胞劃痕的影響健脾消癌方含藥血清處理24 h、48 h后，含藥血清劃痕距離寬于相同濃度空白血清組。處理24 h，與相同濃度鼠血清對照組相比，10%、15%、20%的含藥血清組劃痕距離均較明顯增寬（P＜0.05）；處理48 h，與相同濃度鼠血清對照組相比，10%、15%、20%的含藥血清組劃痕距離均較顯著增寬（P＜0.01），且濃度越大劃痕距離越大。同濃度含藥血清，對細胞遷移抑制能力48 h優于24 h。說明健脾消癌方能夠抑制HCT116細胞的遷移，其抑制作用與濃度和時間呈正相關。見圖1、圖2、圖3，表1。

圖1 含藥血清對HCT116細胞劃痕距離的影響

圖2 對照鼠血清對HCT116細胞劃痕距離的影響

圖3 胎牛血清對HCT116細胞劃痕距離的影響

3.2 健脾消癌方對細胞遷移的影響處理24 h后，與相同濃度鼠血清對照組相比，10%、15%、20%的含藥血清細胞遷移抑制率增大（P＜0.05，P＜0.01），且隨濃度增加遷移抑制率增大。說明健脾消癌方能夠抑制HCT116細胞遷移，與濃度呈正相關。見表2。

3.3 健脾消癌方對細胞侵襲的影響處理24 h后，與相同濃度鼠血清對照組相比，10%、15%、20%的含藥血清細胞侵襲抑制率增加（P＜0.05；P＜0.01），且隨濃度增加侵襲抑制率增高。說明健脾消癌方能夠抑制HCT116細胞侵襲，與濃度呈正相關。見表3。

表1 含藥血清對HCT116細胞遷移距離的影響（n＝3×5，±s）

表1 含藥血清對HCT116細胞遷移距離的影響（n＝3×5，±s）

注：與胎牛血清組比較，*P＜0.05，△P＜0.01；與相同濃度對照組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01；含藥血清48 h與24 h比較，○P＜0.05

組別0 h（l/cm）24 h（l/cm）48 h（l/cm）10%含藥血清組7.11±0.24 4.47±0.32*# 5.10±0.38△▲ 15%含藥血清組6.98±0.31 5.04±0.45*# 5.56±0.51△▲20%含藥血清組7.10±0.25 5.12±0.37*# 6.03±0.41△▲○10%對照鼠血清組7.22±0.36 3.56±0.39 0.55±0.36*15%對照鼠血清組6.80±0.34 3.20±0.40 0.38±0.30 20%對照鼠血清組6.86±0.25 2.95±0.31 0.15±0.23 10%胎牛血清組7.04±0.23 3.05±0.34 0.10±0.06

表2 健脾消癌方含藥血清對細胞遷移的影響（±s，n＝3）

表2 健脾消癌方含藥血清對細胞遷移的影響（±s，n＝3）

注：與胎牛血清組比較，*P＜0.05，△P＜0.01；與相同濃度對照組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

/%10%含藥血清組2.21±0.15*組別OD值遷移抑制率21.9 15%含藥血清組2.17±0.23*#23.3 20%含藥血清組1.39±0.25△▲50.9 10%對照鼠血清組2.52±0.26 10.9 15%對照鼠血清組2.60±0.14 8.1 20%對照鼠血清組2.81±0.20 0.7 10%胎牛血清組2.83±0.18/

表3 健脾消癌方含藥血清對細胞侵襲的影響（±s，n＝3）

表3 健脾消癌方含藥血清對細胞侵襲的影響（±s，n＝3）

注：與胎牛血清組比較，*P＜0.05，△P＜0.01；與相同濃度對照組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

/%10%含藥血清組0.79±0.14*組別OD值侵襲抑制率25.5 15%含藥血清組0.66±0.12△#37.7 20%含藥血清組0.54±0.15△▲49.1 10%對照鼠血清組0.94±0.11 11.3 15%對照鼠血清組0.97±0.13 8.5 20%對照鼠血清組1.02±0.10 3.8 10%胎牛血清組1.06±0.09/

3.4 健脾消癌方對MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響與15%鼠血清對照組比較，15%的含藥血清細胞的MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著下調（P＜0.01）。說明健脾消癌方能夠下調MMP-2、MMP-9蛋白表達。見表4，圖4。

表4 MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平（±s，n＝3）

表4 MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平（±s，n＝3）

注：與胎牛血清組比較，△P＜0.01；與相同濃度對照組比較，▲P＜0.01

-actin 15%含藥血清組0.58±0.04△▲0.34±0.02組別MMP-2/β-actin MMP-9/β△▲15%對照鼠血清組1.06±0.02 0.58±0.03△10%胎牛血清組1.11±0.03 0.72±0.02

圖4 MMP-2、MMP-9蛋白表達水平

4 討論

大腸癌屬于中醫學“腸覃”“腸癖”“臟毒”“癥瘕”“鎖肛痔”等范疇。我院腫瘤中心長期從事中醫藥抗結直腸癌復發轉移臨床及基礎研究，總結腸癌基本病機為“脾虛、瘀積、癌毒”，當以健脾益氣，化瘀解毒為治療法則。擬定健脾消癌方，主要藥物組成有人參、薏苡仁健脾益氣，郁金、莪術活血化瘀，重樓、半枝蓮清熱解毒，全方配伍，寒溫并用，標本兼顧，攻補兼施。

轉移是引起腫瘤患者死亡的主要原因［13］。腫瘤細胞的黏附、遷移能力與癌轉移密切相關。單個腫瘤細胞從原發腫瘤脫落游離是腫瘤侵襲轉移的第一步，腫瘤細胞與細胞之間黏附因子的損失是腫瘤細胞脫離的要素。脫落的腫瘤細胞即為循環腫瘤細胞，與脈管內皮細胞及細胞外基質細胞黏附，遷移到特定的組織器官，并發展成為繼發癌灶的過程，即是轉移。遷移是腫瘤細胞轉移過程中必不可缺的環節之一［14］。故抑制腫瘤細胞轉移的關鍵之一乃是抑制腫瘤細胞向外遷移。

MMPs是一類高度保守的鋅原子依賴內肽酶家族，大部分成員具有降解細胞基膜及細胞外基質功能，是腫瘤細胞轉移過程中的重要分子。MMPs在腫瘤轉移的多個步驟均有參與，包括腫瘤的遷移、侵襲、免疫逃逸、血管的生成、腫瘤的生長［13］。MMP-2和MMP-9是MMPs的明膠酶組成員，通過降解基底膜的膠原成分、細胞外基質和細胞黏附分子，促進血管生成和調節細胞黏附，從而導致癌細胞運動性增強，促進癌細胞侵襲和轉移［15-17］。端傳友［18］檢測86例結腸癌組織及正常結腸組織中MMP-2、MMP-9的表達，發現結腸癌組織中MMP-2、MMP-9表達水平及陽性率均顯著高于正常結腸組織，其中有淋巴結轉移的結腸癌組織中MMP-2、MMP-9陽性表達率高于無淋巴結轉移者，提示MMP-2、MMP-9高表達與腫瘤轉移密切相關。故通過降低MMP-2及MMP-9的表達，可以抑制腫瘤細胞的脫落、遷移，從而降低轉移率。

本研究結果發現，健脾消癌方能夠抑制細胞遷移及侵襲，并下調MMP-2、MMP-9蛋白表達水平，健脾消癌方抗復發轉移機制可能是通過下調MMP-2、MMP-9蛋白表達，從而抑制HCT116細胞遷移、侵襲力。