影響牛胚胎采集效果的因素

韓志強,李志強,張洪濤,陳國福,李 偉,張金友,俞守緒,張 亮

(1.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,黑龍江哈爾濱 150038;2.黑龍江省農(nóng)墾總局動物衛(wèi)生監(jiān)督所,黑龍江哈爾濱 150036;3.黑龍江省家畜胚胎移植技術(shù)開發(fā)中心,黑龍江尚志 150600)

胚胎移植技術(shù)主要包括供受體牛的選擇,供體母牛的超數(shù)排卵,供體與受體牛的同期發(fā)情,胚胎的回收,胚胎質(zhì)量的鑒別,胚胎的冷凍保存,胚胎移植,受體牛的妊娠診斷等[1]。超數(shù)排卵是胚胎移植中關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié),通過超數(shù)排卵技術(shù)可以獲得大量整齊、優(yōu)質(zhì)的卵子,使得優(yōu)良后代數(shù)增加幾倍甚至幾十倍,且好的超排效果還要具有高的可移植胚胎的回收率,才可以使得胚胎移植技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進行,加快優(yōu)良品種的擴繁[2]。現(xiàn)將胚胎采集方法及技術(shù)要點總結(jié)如下:

1 胚胎收集方法

供體牛超排發(fā)情后的第7 d采用二路沖卵管法進行非手術(shù)沖卵。首先將供體牛在保定架保定,用2%的普魯卡因或利多卡因進行尾椎硬膜外麻醉,利多卡因劑量為5～10 mL。注射后1～3 min用手輕輕搖動牛尾,當牛尾呈“蛇樣擺動”時即可進行操作。清洗陰門,然后用衛(wèi)生紙擦干。在二路采卵管內(nèi)插入不銹鋼內(nèi)芯使之挺直,將挺直的采卵管導(dǎo)入陰道達陰道穹窿,另一只手在直腸內(nèi)協(xié)助。慢慢將導(dǎo)管插入子宮體,到子宮角內(nèi)5 cm左右,拔出采卵管內(nèi)的內(nèi)芯約2 cm,再使采卵管沿子宮角彎曲方向進入子宮角深部。在這一過程中,助手每抽出約2 cm的內(nèi)芯,術(shù)者將采卵管向子宮內(nèi)送入相應(yīng)的長度,直到將采卵管送到子宮角適當?shù)奈恢谩２陕压苤械囊宦窞椤皻饴贰?即通過它向氣球內(nèi)充氣;另一路為“水路”。即向子宮內(nèi)灌注和回收沖卵液。充氣后的氣球可將子宮角固定于子宮角大彎附近。此時,將采卵管內(nèi)的不銹鋼內(nèi)芯全部抽出。首先用 50 mL注射器將20～30 mL沖卵液通過采卵管注入子宮角,再將沖卵液吸入到注射器內(nèi)。沖卵液由20 mL逐漸增加到50 mL,每側(cè)子宮角共用沖卵液500 mL。回收的沖卵液輕輕注入到500 mL的集卵杯把集卵杯的回收液在室溫下(18～22℃)靜置20～30 min,上清液通過過濾皿,最后將過濾皿內(nèi)剩下的30～50 mL回收液搖動后倒入100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)。用PBS液沖洗2～3次,清洗液倒入100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)鏡檢、回收胚胎[3]。

2 影響供體牛胚胎回收率的主要因素

2.1 沖卵液內(nèi)含抗生素

胚胎收集時由于過敏反應(yīng),子宮直接接觸到抗生素過敏反應(yīng)非常快,此時子宮角易開始腫脹,采胚時感觸不到采卵管充氣球的位置或是感覺不清子宮內(nèi)液體的充盈程度,同時此刻子宮的收縮力降低,液體回流減緩或不回液,由于輸卵管的一端開口于腹腔,進液不能回流子宮內(nèi)壓增高致使一定的液體和胚胎經(jīng)輸卵管流入腹腔內(nèi)[4]。

2.2 子宮內(nèi)進入氣體

采用注射器推液、抽液的方式進行回收胚胎時不可將空氣帶入子宮角內(nèi),同樣用封閉式回流采集胚胎時必須排除管內(nèi)空氣,如有空氣進入子宮內(nèi)會影響液體的回流,由于空氣的存在使得采卵管回液口接觸不到液體,又采卵管前部沒有回液口致使角尖部液體不能回流,同時由于氣體的存在,子宮角有限的空間內(nèi)減少了進液量,由于氣體使得子宮的腫脹,且氣體在上層很難經(jīng)回液口排除,液體回流不完全或無法回流必將導(dǎo)致胚胎的丟失[5]。

2.3 采卵管堵塞

粘液堵塞進回液口是牛只發(fā)情時分必的粘液沒有完全流出而存留在子宮頸外口,當采卵管通過子宮頸口時粘液會從采卵管的進液口進到采卵管內(nèi),可能會堵塞幾個進液孔,如粘液的量較大或粘度較高時采用封閉式進回液時進液的力度沖不開堵塞在進液口的粘液,采用注射器抽吸法時小力度也很難把粘液沖開。結(jié)果子宮內(nèi)液體無法回流,壓力過大會使得液體經(jīng)輸卵管前端流出或由于壓力過大而使得子宮內(nèi)壁受傷出血。

2.4 采卵管質(zhì)量

由于采卵管質(zhì)量的差異,管前端的固定球囊在外力作用下移動位置,如在子宮內(nèi)液壓的作用下管后移,氣球向子宮角尖部移動堵塞采卵管回液口。此時液體無法回流,如減少氣球圍度會使角內(nèi)的部分液體流到子宮體內(nèi)進而流入對側(cè)子宮角內(nèi),而影響到對側(cè)角的胚胎收集。

2.5 沖胚液進入腹腔

個體差異有些牛只子宮角和輸卵管之間的通透性非常好,如在進液時不將子宮角尖部捏住或提起會有部分液體經(jīng)輸卵管進入腹腔,造成胚胎的不可回收。

2.6 氣球的穩(wěn)定

在采集經(jīng)產(chǎn)牛只時由于子宮彈力的降低,或是子宮內(nèi)存留一定量的粘液,在固定氣球時由于打氣量稍有些小或是進液時采胚人員沒有在球囊后固定球囊使得球后移動,如及時發(fā)現(xiàn)可補一定的氣量繼續(xù)進行采胚。如發(fā)現(xiàn)球囊已退回到子宮角分叉部應(yīng)充分將角內(nèi)液體回流后采對側(cè)角再進管時要適當淺一些,防止由于另一側(cè)采胚時的液體流入所造成的影響。

3 提高胚胎回收率的方法

3.1 應(yīng)用抗過敏藥

如發(fā)現(xiàn)供體牛只有輕微過敏反應(yīng)時此刻在注射抗過敏藥已不可避免子宮的腫脹,而且還會影響到采另一側(cè)子宮角的采卵管固定等工作。如發(fā)現(xiàn)較晚則會影響到采胚工作甚至牛只的生命。如發(fā)現(xiàn)牛只搖頭,并流涎,外陰紅紫既是過敏癥狀,待發(fā)現(xiàn)皮下起疹時應(yīng)加量注射抗過敏藥物,此時如還沒采對側(cè)子宮角時應(yīng)加快速度將采卵管送到位置以免回收不到胚胎。因此采用提前注射抗過敏藥可以有效避免子宮腫脹和不回液現(xiàn)象的發(fā)生。在供體牛只采胚前20 min注射抗過敏藥地賽米松等藥品,避免上述癥狀的出現(xiàn)。

3.2 采卵管故障排除

選用質(zhì)量過關(guān)的采卵管,固定氣球時球的圍度不要超過固定位置處子宮的圍度,在倒角時盡量將采卵管撤出用大量生理鹽水沖洗管內(nèi)的粘液。將采卵管固定好之后第一次進液采用注射器推入法,用五十毫升注射器吸取20～30 mL沖卵液快速注入子宮內(nèi)以其沖出采卵管內(nèi)的粘液以便液體充分回流。

3.3 液體回流

氣囊固定位置要準確,充氣要適宜。若位置太靠后,則氣囊封閉不住子宮角,沖卵時會發(fā)生丟水現(xiàn)象而回流不暢。如太靠前沖卵液不能完全沖回胚胎。采卵管氣球圍度依據(jù)子宮角粗細而定。氣球過于膨脹易損傷子宮內(nèi)膜,使其產(chǎn)生裂痕,沖卵液可滲透到粘膜固有層內(nèi)。氣球小則不能固定采卵管。如發(fā)現(xiàn)回液量小于進液量時應(yīng)在進液時封閉子宮角尖端或是提高其位置,使得液體不外流。

3.4 子宮角褶皺內(nèi)胚胎的回收

第一次向子宮角緩緩注入沖卵液30 mL,使子宮角充盈,粘膜皺褶展開,觸感有緊張度,同時用左手拇指捏住子宮角、輸卵管結(jié)合部并向上提,防止胚胎經(jīng)輸卵管漏斗掉到腹腔。其余手指將子宮角捏在掌心,并不斷由尖端向基部輕輕按摩,使胚胎進入沖胚液中[6]。

[1] 郭志勤.家畜胚胎工程[M].北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社, 1998.

[2] 桑潤滋.動物繁殖生物技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002.

[3] 柳堯波,黃金明.青年荷斯坦牛的超數(shù)排卵試驗[J].中國草食動物,2004,25(1):14-16.

[4] 魏紅芳,郭建來 .牛超數(shù)排卵的方法及影響其效果的因素[J].河南畜牧獸醫(yī),2004,27(10):20-21.

[5] 章志國,張孝榮.動物超數(shù)排卵的影響因素及發(fā)展現(xiàn)狀[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,43(1):41-43.

[6] 李梁材.牛胚胎采集技巧[J].甘肅畜牧獸醫(yī),1990,21(3):38-39.