植物抗病機制與信號傳導研究進展

李智強,戴良英,劉雄倫*,王國梁*

(1湖南農業大學農學院,長沙 410128;2湖南農業大學作物基因工程湖南省重點實驗室,長沙 410128;3湖南農業大學生物安全技術學院,長沙 410128)

在過去的幾十年里,盡管在植物病害控制上取得了重大進展,但全人類的糧食供應仍然受到各種病原菌和害蟲的嚴重威脅。許多病原菌和害蟲可以利用植物作為食物和住所,如病毒,細菌,真菌,線蟲,昆蟲,甚至其他植物[1]。植物在進化過程中,形成了一整套的防御機制來識別和抵抗病原菌的侵染。當病原菌入侵植物體后,植物體會產生一系列的變化來消滅病原菌,如過敏性反應(Hypersensitive Response,HR),被感染的植物組織會得到強化,并且產生能夠殺傷病原菌的代謝產物,同時誘導與防衛相關基因的表達。HR產生的信號在數小時或幾天內使整個組織或植株的防衛基因表達,形成對其他病原菌及后續侵染的抗性,即系統獲得抗性(Systemic Acquired Resistance,SAR),其具有持久性和對病原菌有專化特異性[2]。

對病原菌的特異識別可以激活誘導防衛反應的發生,這一過程主要是由一系列復雜的組成型表達抗性基因(R基因)來完成的。單一 R基因的識別能力非常低,并且要在病原菌含有相應無毒基因(Avr基因)的情況下已能完成識別任務。由這些遺傳學特性可以把這一過程描述成一個簡單的分子模式:植物以 R基因是否能識別出進入植物體的 Avr基因編碼的蛋白為信號來判定病原菌的入侵與否。許多 Avr基因和R基因的克隆以及相關研究已經驗證了這一模式。

整個誘導防衛反應必須要在一定的控制之下來完成,否則同時也會給植物體本身帶來傷害。因此,誘導防衛反應會在特定的時間與空間內發生。這就要求要有一個復雜的、高度完整的信號調控網絡來控制誘導防衛反應的發生。本文概述了植物 R基因和病原菌Avr基因的結構特點、R-Avr基因的互作模式、SA信號傳導途徑與 JA信號傳導途徑及其各自重要相關因子的研究進展。

1 R基因

在病原菌侵染的過程中,植物中 R基因編碼的受體蛋白可以識別 Avr基因編碼的產物蛋白。植物不能像動物那樣可以得益于循環抗體系統,所以它們必須依賴于大量 R基因表達產生的對病原菌的抗性。在過去 20年中,從各種植物體中已經克隆到 70多個 R基因,其中一些已經研究的非常清楚。根據這些R基因編碼蛋白的結構特點,可以將其分為以下幾大基因家族:NBS-LRR(Nucleotide-Blinding Site and Leucine-Rich Repeat),LRR-TM 和 LRR-TM-STK[3,4]。分子遺傳學家已經利用R基因序列的特異性和自然變異性進行 R基因的克隆和研究其分子模型[5]。通過圖位克隆和轉座子標簽等方法,這些基因家族都已在煙草、水稻、擬南芥中得到證實。

1.1 NBS-LRR

植物基因組可以編碼大量NBS-LRR,即核苷酸結合位點和富亮氨酸重復的胞內受體蛋白。根據其編碼蛋白的結構特點,該類基因又被分為四個亞類。第一亞類:LZ-NBS-LRR。 NH2-端有一個亮氨酸拉鏈(LZ)保守區,它是由7個氨基酸構成的重復序列(保守序列為XXXYXXL,Y代表疏水基團)。第二亞類:TIR-NBS-LRR。NH2-端保守區與果蠅發育基因Toll或哺乳動物免疫中編碼白細胞介素-1受體(IL-1R)基因的產物有同源性。第三亞類:TIR(Toll-IL-1R同源區)。該亞類成員有來自煙草的抗煙草花葉病毒的N基因。第四亞類:NBS-LRR。來自番茄的I2和Mi,分別介導對細菌Fusariumox ysporiumf.sp.l ycopersicon和Meloidogyne javanica的抗性。大量的研究表明,LRR的C末端在對病原菌的特異識別過程中起關鍵作用。然而,最近越來越多的研究表明,NBS-LRR的 N末端在對病原菌的識別過程中也起重要作用[6]。

1.2 LRR-TM

該類基因產物為錨定于細胞膜上的糖蛋白受體,包括 3個區域:LRR結構域,跨膜區域(Transmembrane Domain,TM)和一個較短的胞內區域[8]。

1.3 LRR-TM-STK

如水稻抗白葉枯病基因Xa21編碼的蛋白是一類受體蛋白激酶,它的產物含有STK和 LRR-TM兩類R基因的結構特點。

然而,有些 R基因并不屬于上述類型中的任何一種。如Rpg5基因編碼的蛋白產物有典型的 NBSLRR和一個蛋白激酶結構域,但有趣的是,總有另外一個單基因與其緊密連鎖,該單基因編碼的產物蛋白是一種未知結構的抗病相關蛋白[9]。另外,抗稻瘟病基因Pi21編碼的富含脯氨酸蛋白包括一個假定的重金屬結合域,可以推測這可能會形成一種新的蛋白質相互作用模式[10]。

2 Avr基因

近些年的研究表明,能夠改變宿主蛋白結構和功能的均為病原菌效應因子中的一些真菌蛋白或小分子物質[11]。 Avr蛋白是一類能夠特異識別宿主相應 R蛋白的病原菌效應因子,從而直接或間接激活宿主對病原菌侵染的防御反應。近年來,在對真菌Avr效應因子鑒定方面取得的重大進展,為更為深入的研究真菌致病的分子機制提供了重要的理論依據,也為研究 Av r效應因子與宿主 R蛋白共進化奠定了重要基礎。

在已經被定位的 40多個真菌 Avr基因中,有9個已經被成功的分離與克隆。PWL1和PWL2是最先被克隆的兩個無毒基因。Orbach等成功的分離出了另一個無毒基因AvrPi-ta,該基因編碼一個由223個氨基酸組成的含有一個保守金屬蛋白酶域的分泌蛋白[12]。最近,采用圖位克隆法,Li等人成功地克隆出了AvrPiz-t基因,通過基因序列比對,未發現與其同源的 Avr基因[13]。 Yoshida等對稻瘟菌全基因組研究發現,生理小種 Ina168基因組中的一段1.68 Mb的序列在生理小種 70-15基因組中是缺失的[14]。更為有趣的是,318個候選 Avr基因均位于這一段基因組序列當中。通過序列比對與遺傳關聯分析確定了3個新的Av r基因,即AvrPia,AvrPii和AvrPik/km/kp。 這 3個Avr基因均為 N端含有信號肽序列的分泌蛋白。AvrPii和AvrPik/km/kp分別編碼含有 85個氨基酸和 113個氨基酸的未知功能蛋白。AvrPii編碼的蛋白含有 170個氨基酸,其中包含一個與蛋白質-蛋白質相互作用相關的保守結構域—— LxAR,該結構域是一種典型的鋅指結構。有趣的是,LxAR結構域在稻瘟菌中是一種常見分泌蛋白上的重要結構(Yoshida,et al,2009)。該組效應蛋白功能的闡明會為病原菌致病的分子機制研究提供理論基礎。

ace1是一種編碼屬于酮聚合酶 /非核糖體肽合成酶(PKS-NRPS)的雜合蛋白的獨特Avr基因。該蛋白在一種聚酮化合物的生物合成過程中起關鍵作用[15]。在水稻體內,與ace1基因相對應的 R基因為Pi33,而Pi33能夠識別的 Avr基因并非ace1基因,而是 ACE1蛋白的次級代謝產物。有趣的是ace1只在侵染植物葉片的成熟附著胞中表達。這些結果表明,ace1的表達與附著胞對植物葉片的侵染過程有關,但不會直接進入水稻細胞引起防御反應。

Avr基因遺傳不穩定性與 R基因相應 Av r蛋白的無毒性喪失是造成病原菌 Avr蛋白遺傳結構高度多樣化的主要原因。病原菌世代較短的特性,使其更容易形成新的 Avr基因與發生致病型改變,這也是使一些高抗的植物品種在幾年內喪失抗性的主要原因。最近對Avr基因的研究取得的重大進展,為闡明無毒基因的遺傳變異與不穩定性提供了理論基礎。通過遺傳突變的方法,包括堿基刪除、定點突變、轉座子插入等,得到了大量的無毒基因。例如,Orbach的研究發現,AvrPi-ta基因的內含子 3和外顯子 4的缺失會增加該基因的毒性。另外,轉座子插入方法往往可以通過改變基因的表達水平與表達模式而改變 Avr基因的毒性,得到新的 Avr基因。Fudal等發現,在ace1外顯子中插入一段 1.9 kb反轉錄轉座子會導致ace1無毒性的喪失[16]。在對AvrPi-ta和AvrPiz-t的研究過程中也發現了同樣的現象。

3 R-Avr基因互作模式

由美國農業部的科學家 Harold H.Flor提出的基因對基因假說,也被稱為受體-配體模型,認為植物多樣性的抗病性反應是以 R基因作為受體蛋白,由病原菌中相對應的Avr蛋白來激活并形成R-Avr復合體,進而激活下游基因而引起的植物生理反應。目前,主要有兩種不同的分子機制來解釋這一模型:R-Avr直接互作與 R-Avr間接互作。 R-Avr直接互作認為,Avr蛋白與 R基因蛋白直接發生互作,進而引發由 R基因介導的植物抗病反應。例如,在對水稻抗瘟基因Pi-ta的研究中發現,在Pita+中發現了 AVR-PITA直接互作,而在Pita-中未發現 AVR-PITA的直接互作,這一研究成果是證明 R-Avr直接互作的最早的實驗證據[17]。然而,到目前為止,還未發現其他的例子證明 R-Avr之間的直接相互作用。與此相反的是,大多數的研究結果表明,R基因與 Avr基因之間往往是通過其他的一些間接性因子來發生相互作用的,這一互作模型往往被稱為“防衛”假說[18]。在該模型中,R蛋白質扮演“衛士”來監控目標蛋白質由于與之相對應的 Avr蛋白入侵而發生的結構或構型的改變。該模型最早是通過對AvrPto/AvrPtoB-Pto-Prf介導的植物抗病性的研究發現的。該模型中,Prf很可能是編碼典型 LZ-NBS-LRR蛋白質的真正 R基因,而作為Avr蛋白受體的 Pto蛋白則是該基因監控的目標蛋白[18]。同樣,擬南芥中的 RIN4蛋白是受到兩個編碼NBS-LRR蛋白質的RPM1和RPS2基因監控,而RIN4蛋白構型的改變是受 3種不同類型的 Avr基因調控的,包括來自假單胞菌syringae AvrRpm1,AvrB和AvrRpt2基因[19,20]。兩個結構類型相差甚大的 Av r蛋白 Av rB與 Av rRpm1,與 RIN4發生相互作用,誘導RIN4的磷酸化反應,進而調控 RPM1介導植物抗病反應。而AvrRpt2是一種半胱氨酸蛋白酶,其主要作用是以 RIN4為靶蛋白并降解其轉錄產物誘導 RPS2介導的植物對病原菌的防御反應。最近,在對擬南芥的研究中發現,由PBS1基因編碼的絲氨酸-蘇氨酸激酶蛋白質受RPS5嚴格的監控,而這個絲氨酸-蘇氨酸激酶蛋白正是 Avr-RphB蛋白的受體蛋白,這一研究成果進一步證明了“防衛”模型假說[21]。

目前,大量的實驗數據表明,植物可能擁有多種不同的防御機制,防止各種病原菌的侵染。植物的R基因與病原菌的Avr基因的共同進化使不同的R蛋白與多樣化的 Avr蛋白保持著良好的平衡性[22]。總的來說,在這兩個模型假說中,具有保守結構的 R蛋白可以通過與 Avr蛋白發生直接相互作用,或通過作為 Avr蛋白受體的植物內在蛋白而發生間接的相互作用。然而,盡管有各種各樣的假說被提出,但 R-Avr之間的相互作用還不是很清楚,需要進一步的研究。

4 植物抗病信號傳導

在植物的抗病反應過程中,R基因識別 Avr基因后所產生的抗病信號須由植物體內源信號分子從受侵染部位傳導至整株植物,引起系統性抗性,因而植物體內源信號分子在植物抗病信號傳導途徑中起重要作用。目前研究較為清楚的植物內源信號分子有水楊酸(Salicylic Acid,SA)、 茉 莉 酸 (Jasmonic Acid,JA)。SAR和 HR需要 SA介導,被稱之為 SA依賴性途徑(SA-Dependent Pathway),這一途徑中 PR21蛋白協同表達;ISR是獨立于SA與PR21基因的,需要通過植物激素JA介導。Morriseey和Osbourn用JA處理可降解 SA的轉基因擬南芥,誘導產生了系統性抗性,說明這一途徑與 SA無關,稱之為 SA非依賴性途徑(SAIndependent Pathway)[23]。

4.1 SA信號傳導途徑

SA作為植物產生局部抗病反應與系統獲得抗性反應(SAR)的重要的信號分子,已被廣泛研究。植物對病原菌的侵染會導致其體內 SA含量的顯著變化。研究發現,植物體內 SA含量的增加與植物出現抗病反應、編碼防衛相關蛋白的基因過量表達表現正相關性。通過基因敲除的方法,沉默 SA合成過程中重要基因,以及通過轉基因的方法,將細菌水楊酸羥化酶基因(NahG)轉入植物中,均可以有效阻止 SAR的激活,同時,外源 SA也可以激活防衛反應基因的超表達,進而增強植物對病原菌的抗性,產生 SAR。這些實驗說明,SA是植物抗病信號傳導與 SAR形成過程中必不可少的信號分子。

通過遺傳篩選的方法,已經在擬南芥中找到大量參與 SA合成、SA信號傳導的基因。npr1基因也被稱為nim1基因,是 SA信號傳導途經的重要基因之一。npr1基因突變的擬南芥對 SA不敏感,不表達防衛基因,不表現抗病性,但體內仍積累與野生型植株等量的SA[24],說明npr1基因位于 SA信號途徑的下游,而在防衛基因表達的上游[25,26]。在擬南芥和水稻中過表達npr1基因可以提高對病原菌的抗性。 SA或其類似物幫助NPR1蛋白轉運到細胞核,進而激活下游防衛基因表達。NPR1蛋白包含一個錨蛋白重復結構域,該結構在已知功能蛋白中,是參與蛋白—蛋白互作的重要結構。該結構域突變體證明其對 NPR1蛋白行使正常功能起到重要作用。

4.2 JA信號傳導途徑

茉莉酸(JA)及其化合物作為植物調節激素,調控著植物種子萌發、果實成熟、花粉形成、根的伸長、卷須纏繞、葉片脫落和衰老等植物生育期的各種生理變化。他們也參與植物對機械傷害、紫外線照射、干旱、病原體侵染和昆蟲啃食等傷害的抗性反應。對模式生物擬南芥的各種 JA突變體進行研究,已經發現了大量 JA信號傳導通路中的關鍵因子。

在篩選根伸長 JA不敏感突變體的過程中,得到JA不敏感突變體 jar1,JAR1蛋白屬于酰基腺苷酸式螢火蟲熒光素酶家族的一員,可以促進生化過程中的一些底物分子參加后序生化反應[27]。COI1突變體是可以耐受細菌冠毒素和茉莉酸甲酯的一種突變體。該突變體是由于 JA誘導基因,包括AtVSP,tive,Thi2.1和PDF1.2發生了突變形成的。該突變體表現雄性不育,并對病原體侵染不具抗性。coi1基因編碼一個 66 kD的蛋白質,該蛋白包含一個富含亮氨酸重復結構域和一個N端的F-box結構域。隱性突變體jin1和jin4同樣是在篩選根伸長 JA不敏感突變體的過程中得到的。在這兩種突變體中,茉莉酸甲酯誘導基因AtVsp的表達量比對照組野生型中的表達量明顯降低。jin1基因編碼 AtMYC2蛋白,是屬于一種螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈類結構的轉錄因子,該基因的表達受 JA的正調節。 jar1,jin1和 jin4突變體是可育的,而 COI1突變體是雄性不育的。coi1基因對依賴JA調節植物的育性與防御反應是必須的,這一現象說明coi1基因位于 JA信號轉導途徑的上游。

一般認為,JA與其甲酯(MeJA)是植物體內包括細胞內和植株間可移動的信號分子,但由于目前還未分離和鑒定出 JAs受體,其誘導的植物抗病信號傳導途徑還不完全清楚[28]。通過對擬南芥 JA不敏感突變體 COI1的研究發現,coi1基因編碼一種富含 LRR重復序列與具有 F-box序列的蛋白可以和感應 JA信號的負調控因子(Skp1和 Cullin等)結合而形成一個 E3泛素連接酶復合(SCFCOI1),該復合體可被泛素酶解系統來識別并可以選擇性的降解負調控因子,即泛素通過降解SCFCOI1中的抑制因子而保證 JA信號的正常傳導[29]。

5 展 望

雖然在植物抗病分子機制方面的研究取得了令人興奮的成就,但對植物抗病機制的研究仍然是針對某些具體抗病基因本身的一些特點而開展的,而且大多處于描述水平或只確定了不多的一些功能;對植物 R

基因與病原菌 Avr基因識別分子機制的了解還不是很清楚;各種防御信號傳導網絡模型還不是很完善。因此,只能通過對植物抗病機制進行更為精細的研究,來解決上述問題,才能設計出更為合理、有效的策略,以充分利用植物 R基因、抗病信號傳導網絡為人類服務。

在短期內,人們期望更多的、有效的 R基因被克隆,同時來自擬南芥的抗病信號傳導模型也會被證明適用于其它的農作物[30]。從長遠來看,對識別病原菌的結構基礎的詳細理解,可以更好的設計出完美的抗性蛋白來識別重要的無毒因子。隨著功能基因組工具在植物抗病方面得到廣泛應用,大大的加快了人們對植物抗病信號傳導和其它植物進程中相互作用的新發現和新認識理解的步伐[31]。由于病原菌超強的適應能力,很難輕易得到一個具有持久性、廣譜性的抗病材料。但是,令人期待的是,特定的抗病基因在一定的遺傳背景下,并且結合其他適當的控制措施,獲得穩定的、良好的抗性也是可以實現的。

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