苯磺酸氨氯地平分散片人體生物等效性試驗研究

連柏楊 謝秋紅

苯磺酸氨氯地平(amlodipine besylate)是二氫吡啶類長效鈣離子拮抗劑，通過選擇性抑制血管平滑肌內鈣離子通道的內流，松弛血管平滑肌，降低外周血管阻力，從而達到降低血壓的目的[1]。在臨床上，主要用于治療高血壓，心絞痛，尤其是自發性心絞痛[2]。本試驗用HPLC-MS法測定苯磺酸氨氯地平在血漿中的血藥濃度，選擇同類制劑氨氯地平片劑作對照，并評價兩種制劑的人體生物等效性，為臨床應用提供依據。

1 方法學考察與評價

1.1 標準曲線的制備取空白血漿1000 μl，分別加入苯磺酸氨氯地平標準溶液100 μl，制成相當于苯磺酸氨氯地平血漿濃度為0.15、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 ng/ml的系列標準血漿樣品，按“血漿樣品預處理”項下方法操作，每一濃度進行雙樣本分析，并記錄色譜峰面積和圖譜。

由測得的苯磺酸氨氯地平峰面積內標物尼莫地平峰面積的比值R對血漿藥物濃度C進行線性回歸分析[3]，用加權(w=1/χ2)最小二乘法[4]求得標準曲線回歸方程:R=0.2eC-2.8×10-2，r=0.9982。其線性檢測范圍:0.15～16.0 ng/ml，定量下限為0.15 ng/ml(S/N≥3)。

1.2 專屬性氨氯地平和尼莫地平(內標物)離子化源為ESI源;檢測方式:正離子檢測;掃描方式:多反應離子監測(MRM)方式，定量分析時的離子反應分別為m/z 409→m/z 238(氨氯地平)和m/z 419→m/z 343(內標尼莫地平)，其二級全掃描圖和結構見附圖1。

分別取6名健康受試者的空白血漿1000 μl，除不加內標外，按“血漿樣品處理”項下方法操作(以甲醇代替內標溶液)，進樣5 μl，記錄色譜圖;將一定濃度的苯磺酸氨氯地平標準溶液和內標溶液加入空白血漿中，依同法操作，得色譜圖。氨氯地平的保留時間為0.75 min，內標尼莫地平的保留時間為1.38 min;取健康受試者給藥后收集的血漿樣品，依同法操作，記錄色譜圖。結果表明，空白血漿中的內源性物質和代謝物不干擾血漿中苯磺酸氨氯地平和尼莫地平(內標物)的測定。

1.3 萃取回收率、精密度在空白血漿中精密加入苯磺酸氨氯地平系列標準溶液，制成0.5、2.0、12.0 ng/ml的3個標準系列血漿樣品，每一濃度進行6樣本分析。同時，另取空白血漿1000 μl，不加苯磺酸氨氯地平系列標準溶液和內標溶液，其他按“血漿樣品預處理”項下的方法操作，取5 ml進樣分析。獲得相應的峰面積(三次測定的平均值)，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率[5]。

在空白血漿中精密加入苯磺酸氨氯地平系列標準溶液，制成0.5、2.0、12.0 ng/ml 3個標準系列血漿樣品，每一濃度進行6樣本分析，連續測定3 d，計算日內、日間精密度，結果均在要求范圍內。

1.4 穩定性試驗在空白血漿中精密加入苯磺酸氨氯地平系列標準溶液，制成0.5、2.0、12.0 ng/ml 3個標準系列血漿樣品(每濃度3樣本分析)，分別進行室溫下放置8 h、-20℃保存30 d、3個冷凍-解凍循環后穩定性試驗。結果顯示苯磺酸氨氯地平高、中、低3個濃度血漿樣品，在室溫下放置8 h內穩定，RSD＜10%;-20℃保存的苯磺酸氨氯地平血漿樣品在30 d內穩定，RSD＜15%;苯磺酸氨氯地平血漿樣品經過3個冷凍-解凍循環后穩定，RSD＜10%。

1.5 數據處理用DAS2.0軟件處理20名受試者各取血點的HPLC-MS測定結果，其中Cmax和Tmax取實測值，AUC用梯形面積法計算。對Cmax、AUC、AUC的對數轉換值及Tmax的實測值進行方差分析和雙單側t檢驗及90%可信限判斷，以AUC:80%～125%和Cmax:70%～143%為判定標準[5]，考察兩制劑是否具有生物等效性。根據兩制劑中苯磺酸氨氯地平的AUC0-144計算相對生物利用度。

2 結果

2.1 血藥濃度-時間曲線20名健康受試者單次口服苯磺酸氨氯地平試驗制劑和參比制劑10 mg后的血漿中氨氯地平濃度范圍為0.16～8.6 ng/ml，在本試驗的線性范圍內。

2.2 生物等效性苯磺酸氨氯地平分散片試驗制劑的相對生物利用度為(97.6±14.8)%。兩制劑主要藥動學參數經配對t檢驗，結果表明，兩種制劑的藥動學參數差異均無統計學意義(P＞0.05)。AUC0-t，Cmax經對數轉換后進行藥物間、周期間、個體間的3因素方差分析，雙單側t檢驗均無顯著性差異。lnAUC0-t，ln Cmax的(1-2α)90%置信區間為90.8%～102.6%和81.9%～98.3%。結果表明，兩制劑具有生物等效性。

3 討論

液相色譜-質譜聯用技術(LC/MS/MS)是一種將質譜儀作為檢測器的色譜技術，它將HPLC的高分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性有機結合起來，具有樣品處理簡單、快速，方法的專屬性及選擇性均較高等特點。因此，它成為藥物代謝與藥物動力學研究中強有力的工具，而廣泛應用于藥物的開發及臨床應用研究。本試驗結果表明，應用LC/MS/MS法測得的苯磺酸氨氯地平在健康人體內的藥動學參數與已有研究報道基本一致[6，7]。本試驗方法學驗證結果顯示，苯磺酸氨氯地平血藥濃度測定的標準曲線的線性范圍為0.15～16.0 ng/ml(r2=0.9982)，苯磺酸氨氯地平血藥濃度測定的最低檢測限度為0.15 ng/ml，日內、日間變異系數以及提取回收率亦均符合生物樣品分析要求，證實了本試驗方法的可靠性與準確性。

[1]許俏紅，楊政.洛活喜的動力學與臨床應用.海峽藥學，1997，9(3):110-111.

[2]王江紅.苯磺酸氨氯地平片研究新進展.中國藥業，1998，7(10):39.

[3]SFDA.藥品臨床試驗管理規范，2003.

[4]鐘大放.以加權最小二乘法建立生物分析標準曲線的若干問題.藥物分析雜志，1996，16(5):343-346.

[5]中華人民共和國藥典2005年版附錄ⅩⅨB藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導原則.化學工業出版社，2005.

[6]張孝清，陸宏國，徐玉鳳，等.苯磺酸氨氯地平片相對生物利用度研究.中國新藥雜志，2003，12(10):849-851.

[7]欒燕，張逸凡，陳笑艷，等.氨氯地平在中國受試者體內的藥物動力學及制劑的生物等效性.沈陽藥科大學學報，2000，17(5):327-380.