實時熒光PCR技術在手足口病原學檢查中的應用

王七生，秦金勇，蔣立立

桂林市疾病預防控制中心檢驗科，廣西桂林 541001

手足口病是腸道病毒引起的急性傳染病，具有流行性強、傳染性強、傳播途徑復雜等特點，好發于兒童（5歲以下），手足口病較常見的病原體是柯薩奇病毒A16型（CoxA16）和腸道病毒71型（EV71）[1-2]。近年來該病呈現出了新的特點：①發病高峰期明顯提前；②全國高發地區區域擴大，且發病強度高于往年；③發病90%以上為5歲以下兒童，托幼兒童和散居兒童大約各占一半；④實驗室確診的病例大多數是EV71型，危重患兒病例增加。這為及早、迅速和準確地檢測確定手足口病原體傳染性疾病的治療與預防提出了更高的要求。本文采用實時熒光PCR技術，對桂林市婦女兒童醫院確診的手足口病患兒進行腸道病原學進行鑒別與分析。現將實驗報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

樣本來源于桂林市婦女兒童醫院，2010年臨床確診為手足口病的患兒，共40例，診斷依據衛生部發布的《手足口病預防控制指南》（2008 版）[3]。 年齡 0.75～10.00 歲，平均 3.15 歲。均使用肛拭子法采集患兒糞便標本，共計40份樣本，樣本均按照《手足口病預防控制指南》的要求進行采集儲存及轉運操作。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 樣本采集使用肛拭子法，用無菌棉簽采集患兒的糞便，放于病毒漢格氏液保存管，冷藏運至實驗室，-20℃保存，取上清200 μl用于提取病毒RNA[4]。

1.2.2主要試劑及儀器 本實驗室用熒光PCR儀器為美國ABI公司生產，型號為7500。所用分光光度計為美國Varian生產的Cary50Probe紫外光度計。所用超速離心機為德國Eppendorf生產。試劑盒包括提取RNA的試劑盒等均購于北京金豪生物有限公司。

1.2.3 檢測試劑 腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒，適用于EV71、柯薩奇病毒的核酸篩查，柯薩奇病毒A-16核酸檢測試劑盒（CVA-16）適用于柯薩奇病毒A-16病毒核酸的特異性檢測；腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（EV71）適用于腸道病毒71型核酸的特異性檢測[4-5]。引物及探針信息：EV-Com引物（上游）：5’-GTG TGT CGT AAC GGG CAA CTC-3’；EV-Com 引物（下游）：5’-TTT CAA TTG TCA CCA TAA GCA GC-3’；EV-Com 熒 光 探 針 ：5’-ACC GAC TAC TTT GGG TGT CCG TGT TTC C-3’；CVA-16 引物（上游）：5’-CCA TTG GTG CTC CCA CTA CA-3’；CVA-16 引物（下游）：5’-GCT TCA GTG TTG GCA GCT GTA G-3’；CVA-16 熒光探針：5’-CTG TGA ACA ACC AAG TAA ACC GCT CC-3’；EV71 引物（上游）：5’-CAG AAC ACA CAG GTG AGC AGT C-3’；EV71 引物（下 游）：5’-GCG TGT CTC AAT CAT ACT CTC ATC-3’；EV71 熒光探針：5’-CCA GCA CTC CAA GCT GCT GAA ATT GG-3’。

1.2.4 實時熒光PCR檢測 肛拭子法提取并處理的40份樣本，按照試劑盒說明書操作，首先使用Trizol法提取標本的RNA，然后在擴增儀上將萃取得到的RNA進行擴增，最后根據PCR試劑盒提供的優化方法進行退火溫度、離子濃度、探針濃度、引物濃度等優化處理，并建立標準曲線[6-7]。標準曲線建立方法即：將陽性標準品置于260 nm紫外光下進行吸光度測定，以計算出DNA的拷貝數。并分別連續10倍稀釋且進行熒光PCR檢測以獲得標準曲線，且經重復性、敏感性檢測。所有操作完成時間為3～4 h。

1.3 統計學處理

將實驗數據建立Excel數據庫，采用SPSS 18.0統計學軟件分析，計量資料采用非參數秩和檢驗。P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本標準曲線

用10倍倍比稀釋的標準模板作定量標準曲線，CVA-16標準曲線相關系數分別為r=0.914，曲線斜率為-3.167；EV71標準曲線相關系數分別為r=0.952，曲線斜率為-3.382；EVCom標準曲線相關系數分別為r=0.964，曲線斜率為-3.386。線性相關性良好。PCR擴增效率為94%，說明PCR反應對模板的擴增很完全。

2.1 肛拭子標本的實時熒光PCR檢測結果

40份肛拭子標本通過前述3種核酸檢測試劑盒的實時熒光PCR檢測，檢測結果：腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒（EV-Com）陽性為22例，柯薩奇病毒A-16核酸檢測試劑盒（CVA-16）陽性為9例（占22.5%），腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（EV71）陽性為12例（占30%），其中CVA-16或EV71陽性，都同時為EV-Com陽性。EV-Com陽性病例的肛拭子標本采集時間為起病后1～7 d，發病3 d的肛拭子樣本EV-Com陽性病例占75%。

3 結論

實時熒光PCR是一種核酸定量技術，具有普通PCR的高靈敏性[8]，已經成為腸道病毒診斷的重要手段。本研究中采用實時熒光PCR方法，嚴格按照檢測試劑盒說明書操作，對利用肛拭子法采集的共40份標本進行了病毒Cox A16和EV71的核酸檢測。結果CVA-16標準曲線相關系數分別為r=0.914；EV71標準曲線相關系數分別為r=0.952，柯薩奇病毒A-16核酸檢測試劑盒（CVA-16）陽性為9例，腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（EV71）陽性為12例，結果與有關文獻相似[9]。研究發現手足口病病毒檢出率與標本的采集時間相關性，發病前3 d的肛拭子樣本進行檢查更利于病原學檢出。而CVA-16和EV71腸道病毒還是手足口病的主要病原體，實時熒光PCR技術對手足口病的病原診斷具有重要價值，它操作簡便，穩定性良好，重現性好[10]，可以在3～4 h內獲得檢測結果，可以作為手足口病腸道病毒的快速檢測方法，為臨床及時采取救治方案提供一種早期診斷依據[11]。

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