組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275在體外抑制胃癌細胞的實驗研究

劉瑾 任亞嬋 吳智群

1.西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069；2.第四軍醫大學附屬唐都醫院介入放射科，陜西 西安，710038

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，其死亡人數在我國居惡性腫瘤的首位［1］，每年約有17萬人死于胃癌。手術對早期胃癌有較好的療效，但對中晚期的胃癌療效欠佳。由于化療和放療對胃癌的有效率均較低，因此，尋找不良反應小，療效好的腫瘤靶向治療藥物已經成為腫瘤治療研究的熱點。

近年來，研究發現組蛋白的乙酰化和去乙酰化在基因的表達調控中起著非常重要的作用，組蛋白乙酰化和去乙酰化的紊亂與癌癥的發生密切相關［2］。進一步研究證實，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACis)能夠誘導腫瘤細胞分化、生長抑制及凋亡［3］，已經成為一種抗癌新藥受到越來越多的關注，MS-275就是眾多HDACis之一。MS-275是一種合成的苯甲酰胺衍生物，能顯著抑制HDAC1(IC50=300 nmol/L)和HDAC3(IC50=8 μmol/L)，對HDAC8(IC50>100 μmol/L)抑制效果不佳。MS-275對腫瘤細胞作用強，不良反應相對較小，且在人體內穩定性好，并且MS-275可以通過微芯生物設計合成，還可通過口服途徑給藥，具有較好的臨床應用前景［4］。本研究旨在研究MS-275對胃癌細胞及正常細胞的作用，以期闡明MS-275對胃癌細胞的選擇性殺傷作用，為臨床的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

MS-275購于美國Merck公司，SGC-7901(人胃低分化腺癌)細胞由第四軍醫大學細胞生物中心提供，GES-1(人正常胃黏膜細胞)和張氏肝細胞(CHANG-LIVER)購于博慧斯生物公司，RPMI1640培養液及胰蛋白酶購于Hyclone公司，胎牛血清購于美國GIBCO公司，二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma公司，TUNEL檢測試劑盒(in situ cell death detection kit，POD)購于Roche公司；Cell Proliferation Reagent WST-1購于碧云天生物技術公司。

1.2 細胞培養

SGC-7901和張氏肝細胞用含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的RPMI1640培養基在37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養；GES-1用含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養基在37 ℃，CO2體積分數為5%的培養箱中培養。

1.3 MS-275對SGC-7901細胞生長影響的檢測

取對數生長期的SGC-7901細胞，用胰酶消化后吹打成單細胞懸液，以1×104mL-1的密度接種于96孔板，每孔100 μL，共接種5塊96孔板，以不含細胞的培養基為空白對照。待24 h細胞完全貼壁后，加入MS-275，終濃度設置1、2、4和8 μmol/L的濃度梯度，每個 濃度3個平行孔，對照組不加MS-275。每24 h取出一塊96孔板，每孔加WST-1 10 μL，37 ℃溫箱中溫育4 h后酶標儀450 nm測定吸光值(D)，以 空白對照孔調零 ，根據吸光值結果計算：腫瘤細胞生長抑制率(%)=(1-D實驗組/D對照組)×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

將貼壁良好的細胞用無血清培養基同步化24 h，經一定濃度MS-275處理48 h，對照組細胞為同樣條件下的不加藥細胞。收集處理組和對照組細胞，控制密度在1×106mL-1左右，PBS清洗2次，加入190 μL Annexin V緩沖液，再加入10 μL Annexin V-FITC(20 μg/mL)，混勻，室溫溫育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC緩沖液，再加入10 μL PI(20 μg/mL) 輕輕混勻，冰浴避光放置，用流式細胞儀檢測凋亡細胞。

1.5 TUNEL實驗

按照Roche公司POD的操作說明進行操作實驗。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 MS-275對SGC-7901細胞的生長抑制作用

一定濃度的MS-275對SGC-7901細胞具有生長抑制作用，且這種抑制作用呈時間和劑量依賴性。處理時間越長，濃度越高，抑制作用越明顯。與陰性對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 不同濃度的MS-275給藥不同時間后對SGC-7901細胞的生長抑制作用Tab.1 The inhibition of different concentration of MS-275 on cell growth of SGC-7901 cell in different time(n=3)

2.2 MS-275對SGC-7901細胞及正常細胞的凋亡誘導作用

設不加MS-275的對照組、1和4 μmol/L MS-275處理48 h的SGC-7901細胞和正常細胞，流式細胞儀檢測凋亡情況，SGC-7901細胞的凋亡率分別為2.7%、7.5%和38.1%(圖1)；正常細胞GES-1的凋亡率分別為0.63%、0.43%和1.06%(圖2)；張氏肝細胞的凋亡率分別為1.47%、2.97%和2.85%(圖3)。一定濃度MS-275(2 μmol/L)分別處理SGC-7901細胞24、48和72 h后，流式細胞儀檢測凋亡情況，SGC-7901細胞的凋亡率分別為3.5%、21%和5 8.5%(圖4)。

圖1 MS-275對SGC-7901細胞凋亡的作用呈劑量依賴性Fig.1 Apoptosis in SGC-7 901 cell induced by MS-275 is a concentration-dependent mode

圖2 MS-275對人正常胃黏膜細胞GES-1的作用Fig.2 The effect on human normal gastric mucosal cell GES-1 after treated by MS-275

2.3 TUNEL實驗觀察發生凋亡的細胞

2 μmol/L MS-275處理SGC-7901細胞48 h后，TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法)染色，可特異性標記細胞核內的DNA斷裂末端，觀察到MS-275處理后的細胞，核內被綠色熒光標記，MS-275未處理的對照組則沒被染色。

圖3 MS-275對人正常肝細胞張氏肝細胞的作用Fig.3 The effect on human normal hepatic ce ll CHANGLIVER after treated by MS-275

圖4 MS-275對SGC-7901細胞凋亡的作用呈時間依賴性Fig.4 Apoptosis in SGC-7901 cell induced by MS-275 was a time-dependent mode

圖5 TUNEL實驗對比圖Fig.5 TUNEL experimental comparison picture

3 討 論

組蛋白乙酰化是調節基因表達的表觀遺傳修飾的一種，調節組蛋白乙酰化程度主要由組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)來相互協調完成。組蛋白乙酰化紊亂可能會導致染色體結構變化，調節細胞周期。分化以及凋亡的基因轉錄水平的失調［5］。組蛋白乙酰化狀態利于基因表達，反之去乙酰化則與基因沉默相關，而大多數腫瘤細胞都存在著高度的組蛋白乙酰化［6］。HDACis可以抑制HDACs的作用，從而抑制腫瘤細胞的復制，成為近年來的抗癌藥物的研究熱點。MS-275是一種新型的苯酰胺類的HDACis，MS-275可以通過微芯生物設計和合成，與已經發現的HDACis無結構類似性，但是抑制效率是NaB等天然HDACis的30倍［7］。值得關注的是，MS-275的確具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，但是對于正常細胞卻基本上沒有作用。

SGC-7901細胞是人胃低分化腺癌細胞，在正常條件下生長增殖旺盛，MS-275濃度梯度處理后， WST-1檢測發現，MS-275抑制生長的作用隨著時間的延長和劑量的增加而升高，即MS-275的作用具有時間依賴性和劑量依賴性。這與Baradari等［7］發表的MS-275對膽管癌細胞系的作用和曲巍等［8］報道的MS-275對膀胱癌細胞系的作用相一致。目前的研究證實MS-275主要是通過誘導細胞凋亡和周期停滯抑制腫瘤細胞的生長。正在凋亡的細胞一個比較典型的特征是細胞核內出現DNA斷裂。本實驗中利用TUNEL 染色，可以在熒光顯微鏡下清楚觀察到經過MS-275處理的SGC-7901細胞被染上綠色熒光，表明細胞核里的DNA發生斷裂，而未經過MS-275處理的SGC-7901細胞則沒有被染色。同時利用AnnexinV/PI雙標流式細胞儀檢測發現在同一處理濃度下(2 μmol/L)，SGC-7901細胞分別處理24、48和72 h后，48 h后出現了非常明顯的凋亡，說明MS-275確實會誘導腫瘤細胞發生凋亡，且凋亡率隨著時間的延長逐漸上升，而在固定時間內(48 h)分別用1和4 μmol/L的MS-275處理后，在較高濃度(4 μmol/L)時會出現明顯的細胞凋亡，推測在低濃度時主要是誘導細胞周期的停滯。為了證實MS-275對人正常細胞具有促凋亡作用，本實驗還設了兩種人正常細胞—人胃黏膜正常細胞GES-1和張氏肝細胞進行對照實驗，結果顯示在同等實驗條件下，MS-275對正常細胞基本沒有誘導凋亡的作用，說明MS-275的殺傷作用確實具有選擇性。

本實驗僅是MS-275對腫瘤細胞抑制作用的驗證，下一步計劃利用Western blot實驗來檢測細胞凋亡相關基因和細胞周期相關基因的表達情況，以及caspase家族在MS-275誘導的凋亡中的作用，這將對深入了解MS-275的作用機制起重要作用。

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