Ad-Egr-hTrail聯合放射線對腦膠質瘤細胞殺傷作用的實驗性研究

劉桂紅 章龍珍 唐天友 劉美艷 趙麗

腦膠質瘤是最常見的原發性腦腫瘤，約占全部顱內腦腫瘤的35% ～40%。目前，膠質瘤的治療仍以手術、放療為主。由于大多數膠質瘤呈浸潤性生長，手術難以徹底切除，而且某些腫瘤生長于重要的腦功能區，多為手術禁區，使得放射治療成為腦膠質瘤綜合治療中一個重要的輔助方法。但膠質瘤對射線較抗拒，加上正常腦組織耐受劑量的限制，導致腦膠質瘤放射治療的總體療效不理想。

腫瘤基因-放射治療目的就是試圖通過提高腫瘤的輻射敏感性的同時降低正常組織的輻射損傷開辟新的治療途徑與方法。研究發現Egr-1啟動子可誘導輻射敏感性，而TNF相關的凋亡誘導配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)能選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡而對正常組織無損傷，因此若將兩者共同構建表達調控體，就能很好地達到腫瘤基因-放射治療的目的。因此本實驗在以CMV作為啟動子的腺病毒重組載體Ad-CMV-hTrail作為對照的基礎上，研究Ad-Egr-hTrail單獨及聯合放射線對腦膠質瘤細胞的殺傷作用，為臨床腦膠質瘤基因-放射治療進一步研究提供實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 攜帶人TRAIL基因的增殖缺陷型腺病毒重組載體Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail為上海交通大學醫學院生物化學教研室葛盛芳博士惠贈，U251腦膠質瘤細胞株購自中科院生物細胞學研究所。MTS檢測試劑盒(Promega);DMEM培養基(GIBCO)。PCR反應試劑盒(Fermentas公司);100bp Marker(天為時代公司);引物序列由上海生物工程公司合成：

上游引物(P1)：5＇-GCTGCCTGGCTGACTTACA-3＇，下游引物 (P2)：5 ＇-TGGCTGGTCTAGACAGATTGC-3 ＇，擴 增 片 斷為1037bp。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組腺病毒的擴增 、純化和滴度測定 將攜帶Ad-Egr-hTrail的293包裝細胞從-70℃冰箱取出，-70℃/37℃反復凍融3次，以裂解細胞，釋放重組病毒。將上述細胞裂解液移至離心管中，12000rpm，離心10 min。吸取含病毒的上清液，感染AE25 crma細胞，大量擴增重組腺病毒。Ad-CMV-hTrail擴增方法同上。然后純化及滴度測定。

1.2.2 重組腺病毒的PCR鑒定 為了檢測重組腺病毒是否攜帶目的基因Trail，裂解腺病毒，提取重組病毒基因組 DNA，以上述病毒DNA為模板，加入引物P1和P2于 PCR反應體系，進行PCR反應。PCR反應條件：先95℃預變性5 min;接著94℃ 1 min;60℃1 min;72℃ 90 s;再72℃ 延伸10 min，共30個循環。

1.2.3 實驗分組 實驗分成6組：空白對照組，Ad-EgrhTrail組(Egr組)，Ad-CMV-hTrail組(CMV 組)，Ad-Egr-hTrail+照射組(Egr+照射組)，Ad-CMV-hTrail+照射組(CMV+照射組)，單純照射組。

1.2.4 病毒感染 取指數生長期的U251細胞，接種在96孔細胞培養板中，1×104細胞/孔，每孔 100 μl，每組設4個復孔，48 h后用移液器先將培養板內培養液吸盡，然后每孔加入50 μl新鮮培養液。將Ad-CMV-hTrail及Ad-Egr-hTrail按MOI=100分別感染U251腦膠質瘤細胞，無病毒感染組(對照組，單純放療組)加入等量的PBS液，使病毒與細胞充分接觸，置于孵箱內繼續培養。病毒感染腫瘤細胞2 h后，每孔再補加50 μl新鮮培養液，繼續培養。感染2 d后，倒置顯微鏡下觀察細胞感染情況，并拍照。

1.2.5 照射條件 病毒感染2 d后給予12 Gy-X射線一次性照射，無照射組給予0 Gy-X射線假照射。SSD=100，劑量率0.684 Gy/min。

1.2.6 MTS法測定 MTS法檢測細胞相對存活率。將Cell-Titer 96 aqueous one solution reagent置于室溫，使試劑完全解凍，備用。吸棄培養孔中的培養液，每孔內加入100 μlDMEM和 20 μl的 CellTiter 96 aqueous one solution reagent(同時以只含 100 μlDMEM 和 20 μl的 CellTiter 96 aqueous one solution reagent的培養孔作為調零孔)，培養箱中培養4 h，然后上酶標儀測定490nm處的吸光值(OD值)。按下式計算腫瘤細胞抑制率(每組實驗重復3次)：腫瘤細胞抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100/100

1.3 統計學方法 采用SPSS 12.0統計學軟件進行兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組腺病毒的擴增 倒置相差顯微鏡觀察：重組腺病毒Ad-Egr-hTrail或Ad-CMV-hTrail感染AE25 crma細胞后五日，AE25 crma細胞變圓，聚集成團，呈現明顯的病理效應，表明病毒開始大量擴增，此時開始收集病毒。無病毒感染的AE25 crma細胞為多邊形，呈現均勻的貼壁生長。

2.2 重組腺病毒的PCR鑒定 以病毒Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail DNA為模板加入引物后進行PCR反應，如期擴增出1037bp的hTrail片斷，表明hTrail全長被成功插入到腺病毒基因中。

2.3 兩種腺病毒重組載體及放射線對 U251細胞增殖的影響

2.3.1 Ad-Egr-hTrail對U251細胞增殖的影響 本實驗結果顯示，單用Ad-Egr-hTrail對U251膠質瘤細胞的抑制率僅為5.49%，與空白對照組相比差異無統計學意義(P＞0.05);但Ad-Egr-hTrail與 12 Gy-X射線聯合作用時，抑制率為40.77%，殺傷率提高了7.43倍，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.3.2 Ad-CMV-hTrail對U251細胞增殖的影響 單用Ad-CMV-hTrail對U251細胞的抑制率為24.61%，與單用放射治療組的抑制率(29.55%)相當(P＞0.05)，與空白對照組相比差異有統計學意義(P＜0.01);與12 Gy-X射線聯合作用時，抑制率為45.15%，殺傷率提高了1.84倍，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.3.3 兩種腺病毒重組載體聯合放射線對U251細胞增殖的影響 Ad-Egr-hTrail+照射組及Ad-CMV-hTrail+照射組對U251膠質瘤細胞的抑制率分別為40.77%、45.15%，二者之間比較差異無統計學意義(P＞0.05);與單次大劑量(12 Gy)的放射治療抑制率(29.55%)相比，其放射增敏比分別為1.38、1.53倍。以上結果見表1。

表1 兩種腺病毒重組載體及放射線對U251細胞增殖的影響

3 討論

選擇有效的目的基因是腫瘤基因-放射治療的關鍵。Trail是近年來發現的腫瘤壞死因子家族的新成員，由于其最顯著特點是僅誘導腫瘤細胞凋亡，對正常細胞則無毒性作用［1］，成為目前的研究熱點。Kagawa等［2］采用表達人 Trail基因的腺病毒載體，在體內外轉染膠質瘤細胞系及腫瘤，證明其抗腫瘤作用具有旁觀者效應，即在被轉入Trail基因的腫瘤細胞周圍，未被轉入Trail基因的腫瘤細胞也出現凋亡現象。此外，Trail誘導腫瘤細胞的凋亡不依賴p53基因是否突變，而常規放射療法在腫瘤抑制基因p53基因突變的情況下則出現輻射抗性。研究表明，在高達50%的高級別膠質瘤中p53發生突變或缺失，因而在放療中發生DNA損傷的腫瘤細胞亦能存活和繁殖，且有惡性度增加的趨勢［3］。研究發現不僅放療能通過提高腫瘤細胞DR5受體的表達而增強Trail治療的敏感性［4］，而且Trail亦能增加膠質瘤細胞對放射線和化療藥物敏感性［5，6］。因此TRAIL與放療的聯合應用，不僅減少了單獨應用放療的毒副作用，而且還起到互相增敏作用。

轉移基因的體內表達調控是基因治療的關鍵技術之一，目前在腫瘤基因治療中往往采用啟動子調控體內轉移基因的表達，所用的啟動子分三類：第一類能夠強而持久的驅動下游基因的表達(如 CMV);第二類有組織或腫瘤特異性(如AFP);第三類活性受控于誘導劑或阻遏劑。Egr-1啟動子屬于第三種，它與一般組織特異啟動子誘導持續基因表達不同，Egr-1啟動子受到輻射誘導后的表達為超強性，當輻射反應結束后隨之減弱或終止［7］。Egr-1基因啟動子序列中的放射敏感性CArG盒可感受體內外理化刺激如自由基、電離輻射等，誘導Egr-1基因表達，從而對與之相連的外源基因實現雙向性調控作用［8］。國內相關的研究報道較少。

我們利用Ad-Egr-hTrail感染U251細胞，在以Ad-CMV-hTrail感染作為對照的基礎上，聯合放射治療，發現：①單純Ad-Egr-hTrail對U251膠質瘤細胞的抑制率僅為5.49%，與對照組無明顯差別，但當給與12 Gy-X的照射后，對腫瘤的抑制率高達40.77%，提高了7.43倍，說明Ad-Egr-hTrail具有較強的輻射誘導特性。Egr-1啟動子在感受電離輻射刺激后，的確可以誘導人TRAIL基因的表達，提高TRAIL基因的抗腫瘤作用。Staba等［9］Ad-Egr-TNFα轉染人惡性膠質瘤D54的裸鼠模型，聯合輻射也得出類似的結果。②單純Ad-CMV-hTrail對U251膠質瘤細胞的抑制率為24.61%，與單純大劑量輻射(12 Gy)的抗腫瘤效應(29.55%)相當。說明CMV是一種強而持久的啟動子，其誘導下游基因Trail表達的抗腫瘤作用可以近似達到單次大劑量輻射的效應。當兩者聯合作用時，對腫瘤的抑制率增加到45.15%，僅提高了1.84倍，說明放射治療可增加Ad-CMV-hTrail對U251膠質瘤細胞的殺傷作用，但CMV啟動子無明顯的輻射誘導特性。③Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail兩種腺病毒重組載體聯合放射線對U251細胞抑制率明顯高于單獨放射治療組(29.55%)，其放射增敏比分別為1.38、1.53倍，說明人Trail基因具有輻射增敏作用。

本研究的特色在于把抗腫瘤基因的最新研究成果與輻射研究結合起來，將人Trail基因置于輻射誘導性啟動子Egr-1調控之下，通過輻射誘導人Trail基因的表達，實現了基因表達的時空調控，解決了基因治療中目的基因表達難控制的問題。一方面，輻射作為誘導劑自身不僅具有抗腫瘤作用，而且能提高基因靶向轉移的效率，相對延長轉基因的表達時間［10］。另一方面，具有輻射增敏作用的基因表達產物由于輻射的靶向性而局限于腫瘤局部，既發揮了對腫瘤的治療作用，又使其系統毒性最小化。因此將輻射與攜帶治療基因的輻射誘導表達載體聯合治療惡性腫瘤，將會發揮更加理想的療效。本實驗進一步證實了采用放射誘導的啟動子來增強目的基因的表達是切實可行的有效的基因治療方法。

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