熱休克蛋白70在急性腎損傷中的臨床價值

曾健 林肇得 羅福漳 鄧朝蓬 黃勝 鄧雪強

熱休克蛋白70(HSP70)是所有原核細胞和真核細胞在高溫或應激情況下所產生的一組具有高度保守性的蛋白質。HSP家族是HSP70中最保守和最主要的一類，它在不同的生物中數量和功能均有所不同，在大多數生物中含量最多，而且在細胞應激后生成最為顯著，因此受到廣泛的關注，也是研究得較為深入的一類HSP。國內外有大量動物及臨床實驗已經證實HSP70在心肌、肝臟以及腦的缺血再灌注損傷中高表達并起到保護作用［1-3］，而對腎臟研究方面較少。近幾年來，其在急性腎損傷(AKI)中的作用引起特別的重視，熱休克蛋白70與腎損傷關系已成為國內外的研究熱點。本研究的目的在于通過檢測急性腎損傷患者不同時期血液和尿液中HSP70水平的動態變化，以及分析其與腎功能、致炎因子的相關性，探討HSP在急性腎損傷中的腎臟保護作用和機制。

1 資料與方法

1.1 對象 選擇2008年9月至2011年2月期間，收治于佛山市南海區人民醫院患者，住院內期間新發急性腎損傷男性或女性的患者36例，年齡18～70歲。設置對照組：(27例)均為健康志愿者，男性或女性，年齡20～65歲。本研究符合醫學研究倫理準則(赫爾辛基宣言)。

1.1.1 入選標準包括 參照2005年9月在阿姆斯特丹舉行的急性腎衰竭(ARF)國際研討會提出的急性腎損傷(AKI)定義(診斷標準)是指由導致腎臟結構或功能變化的損傷引起的腎功能突然(48 h以內)下降，表現為血肌酐(Cr)絕對值增加≥0.3 mg/dl(≥26.4 μmol/L)，或者增加≥50%(達到基線值的1.5倍)，或者尿量 ＜ 0.5 ml/(kg·h)，持續超過6 h。并將AKI分為1、2、3期，分別為急性腎損傷1期(危險期)：血清肌酐升高≥0.3 mg/dL(26.4 μmol/L)或為基線值的1.5～2倍;或者尿量＜0.5 ml/(kg·h)，持續＞6 h。急性腎損傷2期(損傷期)：血清肌酐升高至基線值的2～3倍;或者尿量＜0.5 ml/(kg·h)，持續＞12 h。急性腎損傷3期(衰竭期)：血清肌酐升高至基線值的3倍或在血清肌酐＞4 mg/dl(354 μmol/L)基礎上急性增加0.5 mg/dL(44 μmol/L);或者尿量＜0.3 ml/(kg·h)持續＞24 h或無尿持續＞12 h。

1.1.2 排除標準 ①有慢性腎病病史者。②雖無腎病病史但住院體檢發現腎功能異常者。③有糖尿病，紅斑狼瘡及腎腫瘤病史者。④已發生多臟器功能衰竭再出現休克者。

1.2 方法 患者住院期間行腎損傷標志物包括尿、血、組織檢測或影像學方面的檢測，同時記錄尿量，確定符合新發的急性腎損傷的患者。動態觀察腎損傷患者各項指標，按照分期系統進行分期(AKI 1期、AKI 2期、AKI 3期)，檢測AKI患者各期與對照組，使用ELISA檢血HSP70、尿HSP70、血TNF-α、血IL-1等因子，應用BeckmanDUC28型自動生化分析儀測定血清 BUN、Cr。

1.3 統計學方法 用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料數據用±s表示，兩組間比較使用獨立樣本t經驗，多組間相互比較采用方差分析，相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 基本特征 對照組和與急性腎損傷患者年齡、性別、體質量指數在相互之間的分別差異無統計學意義。

2.2 生化指標 AKI患者各期血HSP70、尿HSP70、血BUN、血Cr顯著性高于對照組(P＜0.05)，AKI 3期血 HSP70、尿HSP70、血BUN、血Cr高于AKI 1期比較有統計學意義P＜0.05。AKI患者各期 TNF-α、IL-1顯著性高于對照組(P＜0.05)。AKI 3期血TNF-α、IL-1濃度低于AKI 1期比較有統計學意義P＜0.05見表1。

表1 急性腎損傷患者各期與對照組各項指標分析(±s)

表1 急性腎損傷患者各期與對照組各項指標分析(±s)

注：*與對照組比較P＜0.05，＊＊與AKI1期比較P＜0.05

類別 組數 血HSP70(ng/ml) 尿hsp70(ng/ml) BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) TNF-α(pg/ml) IL-1(pg/ml)對照組 27 4.52±1.24 2.13±1.02 5.25±1.24 68.6±13.5 8.17±2.11 54.12±13.5 AKI 1 36 12.57±2.36* 4.56±2.12* 10.33±3.64* 125.8±24.7* 63.23±13.35* 136.76±56.27*AKI 2 36 15.67±3.28* 7.62±2.14* 15.72±6.75* 186.7±37.5* 50.12±10.32* 110.32±35.46*AKI 3 36 22.68±4.78＊＊ 10.34±3.14＊＊ 23.82±5.44＊＊ 328.6±62.5＊＊ 20.34±7.14＊＊ 80.43±28.32＊＊

2.3 Pearson相關性分析結果 急性腎損傷患者在急性損傷期血HSP70與血BUN、血Cr、尿HSP70呈正相關(r=0.826，P＜0.05;r=0.923，P ＜0.05;r=0.872，P ＜0.05.)，與 TNF-α、IL-1炎性因子呈負相關(r=-0.927，P＜0.05 r=-0.783，P＜0.05.)。

3 討論

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)又稱應激蛋白，是生物體內或離體細胞產生的一組具有高度保守性的蛋白質，目前已發現10多種，根據分子量的不同，可將HSP分為HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和泛醌輔酶 Q等。誘導HSP產生的因素很多，大致分為以下三類：①環境性應激因素，物理性損傷如熱、有機物、氧化劑、某些藥物等。②病理生理性應激因素，微生物感染、組織損傷、炎癥反應、細胞因子等。③正常情況下細胞生長和分化、胚胎發育等。HSP一般不直接發揮生物學作用，而是通過幫助新生蛋白質的正確折疊、移位、維持和受損蛋白質的修復、移除、降解，在應激的不利條件下，提高細胞的抵抗力，起到應激保護作用，HSP的生物學功能可歸納為以下幾個方面：①分子伴侶作用：HSP與其他蛋白質結合，協助與其結合的蛋白質維持構象，參與蛋白質的變構、轉運及降解，而自身不參與蛋白質組成，在應激狀態下，與變性蛋白質結合，促進其修復或消除，在維持受損細胞的生存和功能中更是發揮重要作用。②抗氧化作用：具有抗氧化的生物活性，通過抑制產生氧自由基的關鍵酶即還原型輔酶氧化酶，減少氧自由基的產生和增加內源性抗氧化劑加速氧自由基的清除兩方面降低細胞內的氧自由基，保護細胞免受氧化損傷［4-6］。③抗凋亡作用：研究已證實，HSP70、HSP60均可通過干擾引起凋亡調節蛋白激活的信號轉導通路抑制細胞的凋亡，進而減少組織的損傷，促進應激損傷的恢復。④協同免疫應答：HSP具有類似主要組織相容性復合物結合抗原肽的結構域，結合抗原肽形成HSP-肽復合物，保護抗原肽免受酶降解，并通過自身ATP酶活性及可能的蛋白酶活性對其結合的前體抗原肽分子進行修剪，或者由內質網腔外肽酶進行修剪，使抗原膚適合與分子結合，輔助抗原呈遞，增強免疫應答。

目前國內外對于HSP70細胞內表達規律的認識在不斷深化，近年研究表明，結構型HSP70(HSP73)在正常腎組織有一定量的表達，經過應激或缺血/缺氧后，細胞內HSP70合成機制被啟動，誘導型HSP70(HSP72)合成將顯著增加，并增強機體對隨后進一步損傷的抵抗功能。Martinez等［7］對HSP70的基因結構及調控作過較多的研究，認為當細胞應激后，細胞內未折疊或變性蛋白增多，啟動熱體克蛋白基因的轉錄和表達而合成HSP70。本研究對象中急性腎損傷中血、尿HSP70濃度明顯高于對照組，研究表明，腎組織缺血時，HSP70表達上調。張鴻彥等［8］在慶大霉素引起的急性腎小管損傷中，腎組織HSP73(結構型HSP70)的表達也上調，并且腎小管上皮細胞中HSP73重新分布，由細胞核向細胞漿轉移。HSP具有細胞保護作用，并參與損傷的修復過程。亞砷酸鈉、小劑量環胞菌素A、短暫輸尿管結扎等均可誘導HSP70的表達上調，對隨后的缺血/再灌注或腎毒藥物引起的腎組織損傷有明顯的保護作［9-11］。此外，國內周立文等［12］有報道在相同性質但程度不同的應激條件下，HSP70的合成將隨損傷程度的加深而增加。本研究對象中急性腎損傷中血、尿HSP70在AKI3期較AKI 1期明顯增多有統計學意義，血HSP70與血BUN、血Cr正相關說明HSP70升高可能與腎組織的腎損傷成正比，這與McCabe等［13］曾報道整體動物熱應激后組織損傷的程度與IISP70陽性顯成正比相一致。

急性腎損傷的患者有大量活性氧族(ROS)，淋巴細胞釋放細胞因 IL-1，IL-2，IL-8及 TNF-α等，ROS及細胞因子上調HSP，激活 HSP基因，增強 HSP的表達，使血漿中 HSP70的表達繼續上升達高峰。較早出現的高表達的 HSP70通過發揮其“分子伴侶”作用，抗氧化、抗細胞凋亡、抗炎癥損傷，參與細胞保護等內源性保護機制對腎組織起保護作用，促進了腎功能的恢復，本實驗研究研究與血HSP70與TNF-α、IL-1炎性因子呈負相關。可能HSP70的升高抑制炎癥因子的表達，從而對減少對細胞的損傷。一些研究表HSP70表達增加有明顯的抗炎癥作用，HSP70的抗炎癥作用與其抑制NF-kB的活性，減少炎癥介質產生，以及增加抗炎細胞因子IL-10的表達有關。NF-κB與炎癥反應密切相關，HSP70可抑制TNF-α和IL-1β對 NF-kB的激活，進而抑制 TNF-α和 IL-8的表達［14］。

綜上所述，急性腎損傷HSP70表達增多反映腎損傷的嚴重程度，同時HSP70表達可能抑制炎癥因子的的激活，啟動了內源性保護機制，利于腎臟損傷的修復。

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