CD147、MMP-9與釉質(zhì)型顱咽管瘤侵襲性生長及復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究

田繼輝， 夏志強， 劉仲濤， 高海曉， 劉文慶

顱咽管瘤是顱內(nèi)常見的先天性腫瘤(約占顱內(nèi)腫瘤的4%)，在兒童中占幕上腫瘤的第一位［1］。顱咽管瘤雖屬良性腫瘤，但易于復(fù)發(fā)。有報道，手術(shù)治療顱咽管瘤，病死率高達 38%［2，3］，復(fù)發(fā)率高達58%［4］。特別是兒童釉質(zhì)型顱咽管瘤，以囊性為主，與下丘腦粘連緊密，術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于以實質(zhì)性為主的成人鱗狀乳頭型顱咽管瘤。目前關(guān)于顱咽管瘤復(fù)發(fā)的生物學(xué)機制研究甚少，有報道部分顱咽管瘤向毗鄰腦組織呈絨毛狀浸潤性生長［5］，而腫瘤侵襲性生長的特性無疑與術(shù)后腫瘤細胞殘留、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

CD147又名細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)腫瘤細胞及周圍間質(zhì)纖維細胞分泌MMPs，促進細胞外基質(zhì)和基底膜的降解，導(dǎo)致腫瘤細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移［6］。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metal Proteinases，MMPs)是一系列蛋白水解酶，在腫瘤侵襲和復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用。特別是MMP-9，又稱為IV型膠原酶或膠原酶B，其主要作用底物為IV型膠原。MMP-9是MMPs家族的重要成員之一，通過降解IV型膠原促進細胞外基質(zhì)重塑并破壞基底膜以促進新生血管形成［7］。本文旨在探討CD147和MMP-9在釉質(zhì)型顱咽管瘤中的表達及其與釉質(zhì)型顱咽管瘤侵襲性生長的和復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 40例釉質(zhì)型顱咽管瘤標本2007年12月～2009年12月取自北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，原發(fā)組24例(原發(fā)組納入標準為:第一次手術(shù)，沒有進行放療和化療，腫瘤全切，術(shù)后一年內(nèi)，核磁共振復(fù)查，鞍區(qū)未見腫瘤發(fā)生);復(fù)發(fā)組16例(復(fù)發(fā)組納入標準為:第一次手術(shù)，沒有進行放療和化療，腫瘤全切，術(shù)后一年內(nèi)，核磁共振復(fù)查，鞍區(qū)有明確腫瘤發(fā)生)。其中男18例，女22例;患者年齡-分布1～18歲，平均8.5歲。腫瘤標本取材后甲醛固定、石蠟包埋后做HE染色組織學(xué)分型及免疫組化染色。所有標本均經(jīng)病理科醫(yī)師確診為釉質(zhì)型顱咽管瘤。

1.2 方法、試劑及設(shè)備 免疫組織化學(xué)法步驟:將釉質(zhì)型顱咽管瘤石蠟標本制成4μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟、酒精水化后，浸入3%H2O2溶液中，室溫下孵育10min，蒸餾水沖洗干凈后，電爐或者水浴鍋加熱0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至95℃左右，放入切片加熱10～15min;滴加正常山羊血清封閉液室溫封閉20min;分別滴加兔抗人CD147單克隆抗體，兔抗人MMP-9單克隆抗體在37℃恒溫箱中孵育2h。經(jīng)磷酸鹽緩沖液PBS沖洗3次各5min后，滴加生物素標記的二抗體，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片。以相應(yīng)的乳腺癌腫瘤標本染色作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗染色作為陰性對照(本試驗所用試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。TE2000-U倒置生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3 結(jié)果判定標準 CD147蛋白表達主要位于腫瘤細胞的細胞膜和細胞漿上，呈棕黃色或黃褐色顆粒為陽性，MMP-9以細胞質(zhì)和細胞膜出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性。在高倍視野(×400)下，每張切片隨機觀察5個視野的腫瘤細胞，計算200個腫瘤細胞免疫反應(yīng)陽性的細胞百分比，根據(jù)半定量免疫組織化學(xué)方法，對CD147及MMP-9反應(yīng)細胞顯色強度及范圍進行評價:(1)陰性(-):無陽性細胞染色;(2)弱陽性(+):陽性細胞小于25%或顯色淺;(3)中度陽性(?):陽性細胞在26% ～50%或染色略深;(4)強陽性(?):陽性細胞大于50%或顯色深。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 比較原發(fā)組/復(fù)發(fā)組相應(yīng)數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS軟件(13.0)進行Mann-Whitney檢驗分析與Sprerman檢驗分析，P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化顯色結(jié)果 CD147蛋白表達主要位于腫瘤細胞的細胞膜和細胞漿上，在間質(zhì)中的成纖維細胞上也有少量表達，MMP-9主要以胞漿表達為主，并伴有胞膜表達，呈黃褐色顆粒，同時MMP-9在復(fù)發(fā)腫瘤中的連續(xù)表達主要集中與柵欄狀細胞的底部，而原發(fā)組的表達則不連續(xù)。結(jié)果表明:在復(fù)發(fā)組和原發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147的總陽性表達率分別為87.5%和37.5%，復(fù)發(fā)組中CD147的表達變化明顯高于原發(fā)組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(Z=-2.784，P＜0.05)。復(fù)發(fā)組和原發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中MMP-9的總陽性表達率分別為93.7%和41.7%，復(fù)發(fā)組中MMP-9的表達變化明顯高于原發(fā)組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(Z=-3.367，P ＜0.05)(見表1)。

2.2 相關(guān)分析 Sprerman分析顯示:復(fù)發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147與MMP-9表達呈正相關(guān)(r=0.652，P ＜0.01)，原發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147與MMP-9表達無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

表1 CD147與MMP-9與在復(fù)發(fā)/原發(fā)釉質(zhì)型顱咽管瘤中的表達情況及對比

3 討論

顱咽管瘤的易復(fù)發(fā)傾向，與腫瘤呈侵襲性生長密切相關(guān)。Kawamata T等［8］報道顱咽管瘤雖屬良性腫瘤，但部分腫瘤邊界不清，腫瘤組織呈“指樣”突入毗鄰正常腦組織，從而導(dǎo)致單純顯微手術(shù)難以全切腫瘤，術(shù)后易于復(fù)發(fā)。鑒于此，研究與該腫瘤侵襲性生長、復(fù)發(fā)密切相關(guān)的生物學(xué)標記物，期望能提前判斷腫瘤的侵襲性和復(fù)發(fā)傾向，從而為術(shù)前個體化治療方案的制定及術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的早期預(yù)警提供客觀依據(jù)。

人CD147亦稱細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)，屬免疫球蛋白超家族成員。其主要功能為參與細胞-細胞或細胞-基質(zhì)的粘附，同時具有刺激腫瘤細胞及周圍間質(zhì)成纖維細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，從而進一步降解細胞外基質(zhì)型膠原，促進腫瘤細胞的局部浸潤［9］。有研究報道在膠質(zhì)瘤、骨巨細胞瘤、泌尿系腫瘤、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞中均有CD147表達增強的出現(xiàn)［10］。在部分腫瘤中還發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤惡性程度的增高，CD147表達也隨之增多，且與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)［11，12］。本研究對CD147在釉質(zhì)型顱咽管瘤中的表達進行研究，結(jié)果顯示:CD147蛋白表達主要位于腫瘤細胞的細胞膜和細胞漿上，在間質(zhì)中的成纖維細胞上也有少量表達。復(fù)發(fā)組和原發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147的總陽性表達率分別為 87.5%和 37.5%，復(fù)發(fā)組中CD147的表達變化明顯高于原發(fā)組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(Z=-2.784，P ＜0.05)。CD147 高表達的病例，腫瘤與毗鄰下丘腦結(jié)構(gòu)粘連緊密，表明CD147蛋白在釉質(zhì)型顱咽管瘤的表達上調(diào)，并且其表達率與釉質(zhì)型顱咽管瘤的侵襲和復(fù)發(fā)有關(guān)，隨著腫瘤的粘附，侵襲和復(fù)發(fā)的比例增高，CD147蛋白的表達率也逐步增加，提示CD147與釉質(zhì)型顱咽管瘤的浸潤性生長密切相關(guān)。

MMP-9屬于IV型膠原酶，通過降解細胞外基質(zhì)和破壞基底膜中Ⅳ膠原，促進了腫瘤突破包膜，向毗鄰結(jié)構(gòu)浸潤和轉(zhuǎn)移［13］。以往的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與垂體瘤的侵襲性密切相關(guān)，常常導(dǎo)致腫瘤的侵襲性生長和復(fù)發(fā)［14］。本研究對MMP-9在釉質(zhì)型顱咽管瘤中的表達進行研究，結(jié)果顯示:MMP-9表達的部位主要位于胞漿，同時伴有胞膜染色，其在復(fù)發(fā)釉質(zhì)型顱咽管瘤中的總陽性表達率93.7%，明顯高于原發(fā)組的41.7%(Z=-3.367，P ＜0.05)。MMP-9 高表達的病例，腫瘤與毗鄰下丘腦結(jié)構(gòu)粘連緊密，且即便腫瘤鏡下全切，術(shù)后一年內(nèi)復(fù)發(fā)率明顯高于MMP-9低表達的病例。因此，MMP-9可能成為判斷釉質(zhì)型顱咽管瘤侵襲性和復(fù)發(fā)傾向的生物學(xué)指標。

本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組腫瘤CD147和MMP-9總陽性表達率明顯升高，該組腫瘤多呈指狀或旋渦狀突入毗鄰腦組織，之間無明確的包膜分隔，與原發(fā)組腫瘤包膜相對完整，形態(tài)學(xué)上有較顯著不同。由此，進一步提示，CD147和MMP-9的高表達與釉質(zhì)型顱咽管瘤的侵襲性生長、復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)緊密。本研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147蛋白與MMP-9蛋白常同時表達，二者相關(guān)系數(shù)(r=0.652，P ＜0.01)表明在復(fù)發(fā)組中CD147與MMP-9的表達呈正相關(guān)，提示CD147確能促進MMP-9的產(chǎn)生。原發(fā)組中的表達無明顯相關(guān)性，可能是CD147刺激MMP-9的分泌未達到一定“閾值”范圍區(qū)間。同時可能反映MMP-9的產(chǎn)生不僅與CD147有關(guān)，尚與其他因素有關(guān)。有學(xué)者認為，MMP-9的表達與活性與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等多種活性遞質(zhì)有關(guān)［15，16］，本文亦贊同這一觀點。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CD147、MMP-9在釉質(zhì)型顱咽管瘤侵襲、復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮了重要作用，可能成為評價顱咽管瘤術(shù)后復(fù)發(fā)傾向的潛在生物學(xué)指標。在臨床診治過程中，可通過檢測腫瘤組織CD147、MMP-9表達強度的變化趨勢，在腫瘤全切的基礎(chǔ)上評估復(fù)發(fā)風(fēng)險指數(shù)，為釉質(zhì)型顱咽管瘤的診治及改善預(yù)后提供幫助。

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