Nogo基因和雌激素受體基因多態性與多發性硬化發病易感性的關系

李 晟， 劉 偉， 楊昆勝， 方 瑾， 肖建新， 葉榮蘋， 黃智慧

多發性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種臨床常見的以中樞神經系統白質脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫性疾病。目前普遍認為，多發性硬化是環境和遺傳共同作用的多基因遺傳性疾病，其確切病因尚未完全查清。其中遺傳因素在多發性硬化的發病中起十分重要的作用，本研究以多發性硬化患者和非多發性硬化對照組為研究對象，采用病例-對照研究方法，應用PCR技術對60例多發性硬化患者和120例非多發性硬化患者的Nogo(Neurite Outgrowth inhibitor)基因、雌激素受體(Estrogen receptor，ER)α基因2個基因3個位點的多態性進行了檢測和分析。

1 對象與方法

1.1 對象 (1)多發性硬化組:患者系2007年3月～2010年3月本院及其他合作醫院的門診或住院患者，共60例，主要來源于浙江省，部分來源于云南省，男15例，女45例，均為漢族，年齡17～53歲，平均 (39.22±6.87)歲。病程1個月 ～25年，平均4.07年。全部病例入選標準按照 McDonald(2001)多發性硬化診斷標準。(2)正常對照組:來自本院門診健康體檢者，共120例，男38例，女82例，均為漢族，年齡18～55歲，平均(41.87±7.38)歲。性別和年齡與多發性硬化組匹配。兩組均排除免疫性疾病、其它神經系統疾病、代謝性疾病、嚴重心血管疾病、腎病、糖尿病、肝病、腫瘤等。兩組研究對象均為無血緣關系的散發人群，所有患者均充分了解研究方案并簽署知情同意書。兩組的性別、年齡差異無統計學意義(P＞0.05)，表明兩組資料齊同，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有受檢者均晨起抽取靜脈血3ml，采用DNA試劑盒提取人類白細胞基因組DNA。將提取好的DNA置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 試劑配制及來源 DNA提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)。PCR所需試劑:Taq酶混合PCR試劑(北京天根生化)，D2000分子量標準(北京天根生化)。Nogo基因引物采用Gregorio等文獻中的引物［1］。上游引物為:5’-TCA ACA TGA AAT GCC ACA CAA-3’;下游引物為:5’-CAG TCA GTC TGT GCA ATG AAA-3’(引物由昆明晨綠生物技術有限公司合成)。雌激素受體α基因引物采用李薇等文獻中的引物。上游引物:5’-CTG CCA CCC TAT CTG TAT CTT TTC CTA TTC TCC-3’;下游引物:5’-TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA-3’。凝膠電泳試劑:30%丙烯酰胺、10×TBE、5 ×TBE、過硫酸銨、TEMED(臺灣生工)，DNA Maker(北京天根生化)，6 ×loading buffer(北京天根生化)。

1.2.3 Nogo基因PCR反應體系、反應條件及電泳分析 樣本基因組DNA首先通過PCR擴增。PCR反應體系為:反應總體積為25μl，其中內含50ng基因組 DNA，Taq酶 PCR 混合試劑 12.5μl，引物(10pmol/L)上下游引物各 0.5μl，最后補充去離子水至終體積25μl。PCR反應:采用兩步法，反應條件:94℃預變性5min→94℃變性45s→59℃退火及復性40s，共35個循環。PCR產物電泳分析:PCR產物經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，以5V/cm(1～8V/cm)的電壓進行電泳。溴乙啶室溫染色40min，水洗，UV燈下觀察并照相。按照3種等位基因特異性片段的不同，在電泳圖譜上鑒定Nogo基因3’端未編碼區CAA插入/缺失突變不同的基因型。Nogo基因基因型:電泳圖呈63bp(等位基因Ins，為CAA插入)或60bp(等位基因Del為CAA缺失)條帶，有3種基因型，即Del/Del型、Ins/Del型、Ins/Ins型。

1.2.4 雌激素受體α基因PCR反應體系、反應條件及電泳分析 PCR反應體系為:反應總體積為30μl，其中內含100ng基因組 DNA，Taq酶 PCR混合試劑15μl，引物(10pmol/L)上下游引物各0.5 μl，最后補充去離子水至終體積30μl。因 PvuⅡ、XbaⅠ均位于ER-α的第1內含子上，且其Tm值接近，故兩個基因多態性位點的擴增可采用同一引物，并可在同一條件下進行。PCR反應條件:94℃預變性5min→94℃變性50s→63℃退火及復性60s，共35個循環→末次延伸，72℃10min。PCR產物分別進行PvuⅡ和XbaⅠ限制性內切酶進行酶切，在電泳圖譜上鑒定不同的基因型。ER-α基因基因型:PCR特異性擴增片段為1300bp，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定ER-α的PvuⅡ和Xba I基因多態性。ER-α基因使用PvuⅡ內切酶進行酶切反應可區分出3種基因型:即基因型(終產物為1300bp的單一條帶)，pp基因型(終產物為 1300bp、850bp、450bp的3條帶)，pp基因型(終產物為850bp、450bp的兩條帶);用Xba I內切酶進行酶切反應可區分出3種基因型:Xx基因型(終產物為1300bP的單一條帶)，Xx基因型(終產物為 1300bp、910bp、390bp 的 3 條帶)，xx基因型(終產物為910bp、390bp的兩條帶)。

1.3 統計分析 采用SPSS17.0軟件分析等位基因和基因型頻率與MS的關聯性。以χ2檢驗比較基因突變在研究組與對照組之間的差異。檢驗水準:α=0.05。采用Logistic回歸通過優勢比及其95%可信區間(95%confidence interval，95%CI)分析各等位基因相對危險度。

2 結果

2.1 MS組和對照組Nogo基因多態性基因型頻率和等位基因頻率 結果顯示經χ2檢驗基因型頻率在兩組間Nogo基因型分布差異無統計學意義=7.91，P=0.019 ＞0.05);MS 組和對照組 Del型等位基因頻率分別為53.33%和36.67%，經χ2檢驗兩組間等位基因在兩組間分布差異有統計學意義(χb2=9.11，P=0.003 ＜0.01)(見表1)。

2.2 MS組和對照組雌激素受體α PvuⅡ基因多態性基因型頻率和PvuⅡ等位基因頻率 經χ2檢驗基因型頻率在兩組間PvuⅡ基因型分布差異有統計學意義(χa2=15.66，P=0.000 ＜0.01);MS 組和對照組 P型等位基因頻率分別為49.17%和28.33%，經χ2檢驗兩組間等位基因在兩組間分布差異有統計學意義(χb2=15.21，P=0.001 ＜0.01)(見表2)。

2.3 MS組和對照組雌激素受體α XbaⅠ基因多態性基因型頻率和XbaⅠ等位基因頻率 結果顯示經χ2檢驗基因型頻率在兩組間XbaⅠ基因型分布差異無統計學意義(χa2=4.43，P=0.109 ＞0.05);MS組和對照組X型等位基因頻率分別為26.67%和20.00%，經χ2檢驗兩組間等位基因在兩組間分布差異無統計學意義(χb2=2.06，P=0.151 ＞0.05)(見表3)。

2.4 單因素分析 采用單因素非條件Logistic回歸分析考查2個基因3個位點與MS發病的關系。在納入多因素年齡、發病年齡、性別、飲酒史、吸煙史、家族史及2個基因3個位點的情況下，與MS發病相關的有2個因素，即Nogo基因 Del/Del型(OR 為 1.970，95%CI為 1.151 ～ 3.372;P=0.013)和 PvuⅡ基因 PP 型(OR 為 2.664，95%CI為1.412 ～5.024;P=0.002)，都是多發性硬化的獨立危險因素。其他基因位點的多態性及因素與多發性硬化發病無關(OR 為0.663～1.585;95%CI為0.364 ～3.006，均 P ＞0.05)。

2.5 多因素分析 將單因素分析篩選出的可能危險因素進一步進行多因素Logistic回歸分析，采用似然比檢驗，通過后退法進行模型擬合，最終進入模型的因素有2個(見表4)。

表1 MS患者與對照組Nogo基因多態性基因型分布和等位基因頻率分布

表2 MS患者與對照組雌激素受體PvuⅡ基因多態性基因型頻率和PvuⅡ等位基因頻率分布

表3 MS患者與對照組雌激素受體XbaⅠ基因多態性基因型頻率和XbaⅠ等位基因頻率分布

表4 MS易感基因多態性的多因素非條件logistic回歸分析

3 討論

多發性硬化是由環境與遺傳等多因素共同作用所致，且目前認為多發性硬化是一種多基因疾病。迄今為止，關于多發性硬化的發病機制還遠未闡明。大量流行病學調查和研究證明，遺傳因素與多發性硬化發病密切相關。且國內外均有關于基因多態性與多發性硬化的研究，如國內崔玉真、肖波等［2，3］證實中國南方漢族人群CD24基因及ICOS基因多態性與MS相關，可能是MS的易感基因。本研究所涉及的基因為:Nogo基因和雌激素受體α基因。

Nogo基因定位于染色體2p12-14，長約75kb，包括14個外顯子(外顯子的長度從47bp到2400bp)及8個內顯子(堿基長度19bp-37kb)。在bases 4386-4388有一段CAA序列結構，這個堿基片段的插入和缺失就形成了Nogo基因的兩種等位基因型:插入型(Ins)和缺失型(Del)。通過MS組和對照組Nogo基因多態性分布比較，本研究結果提示Nogo基因多態性突變是多發性硬化發病的獨立危險因素。推測其發生機制為當Nogo基因3’端未編碼區有CAA序列插入時，即Ins型等位基因，在一定程度上降低了Nogo基因的轉錄速度，使Nogo-A蛋白產生減少。Del型等位基因中因為缺乏此序列，轉錄速度相對較高。故推測這兩個等位基因(Ins/Del)有一定的協同作用。也有可能是Nogo基因中片段的插入序列本身改變了mRNA前體剪接步驟，導致不同的cDNA的拼接情況，插入片段的部分序列會保存在成熟的cDNA中，影響Nogo-cDNA穩定性，影響Nogo-A的產生。目前國內外對Nogo基因多態性相關的研究不多，Gregorio等［1］研究結果認為Nogo基因3’端未編碼區CAA Ins/Del(插入/缺失)突變基因型與抑郁癥發病無相關性。Zhou等［4］就Nogo基因3’未編碼區TATC和CAA插入/缺失突變與擴張型心肌病的關系進行分析，研究發現TATC插入/缺失突變與擴張性心肌病有相關性。本研究前期小樣本研究［5］證實Nogo基因與多發性硬化有相關性，但是國內外目前就Nogo基因多態性與多發性硬化的相關研究尚缺乏。

人類的ER基因定位于染色體6q24-27，總共有超過14萬的堿基對，編碼蛋白由595個氨基酸組成，包括8個外顯子和7個內含子，相對分子量為66000人類ER基因已被研究證明有3種多態性，即PvuⅡ、Xba l和BstU I。本研究通過MS組和對照組雌激素受體α基因多態性分布比較，結果提示PvuⅡ基因是多發性硬化發病的獨立危險因素。MS與ER基因多態性的關系國內外均進行了研究。Niino等［6］對日本人群的研究表明，PvuⅡ酶切多態性與MS的發生有關，而XbaⅠ酶切多態性與MS的發病年齡有關。而意大利的一項研究表明ER基因 PvuⅡ和XbaⅠ酶切多態性與MS的發病無關［7］。本研究結果與國內孫慶利［8］等對中國北方人群的研究結果相似，PvuⅡ酶切多態性與MS的發病有相關性，而XbaⅠ與疾病無關。這可能是由于不同種族間基因背景不同所致。ER的基因多態性在不同種族間的分布存在差異性，我國與日本人群的分布較為接近［9］，而與瑞典、美國人群中分布差異較大［10，11］本文的結果與劉浩等人的報告相似。自身免疫性疾病有一種復雜的遺傳模式，其中易感基因的相互作用時有發生。本實驗未發現Xba I基因與MS患病有顯著聯系，表明Xba I基因在MS發病中與Nogo基因及PvuⅡ基因無聯合作用。

綜上所述，本研究多發性硬化組與正常對照組Nogo基因和ER基因的基因型及等位基因頻率分布符合Handy-Weinberg平衡，達到遺傳平衡，具有群體代表性。用logistic回歸分析對多發性硬化3個基因位點以及臨床資料進行分析，結果顯示Nogo基因的等位基因頻率和PvuⅡ基因的基因型及等位基因頻率與MS患病的相關性，兩基因位點可能與MS易感基因相關，但這一結論有待于更大樣本的分析加以驗證。MS患者多合并情感精神障礙及生活質量下降，且研究中發現多發性硬化患者的健康相關生活質量、抑郁焦慮障礙評分等與相關臨床資料及基因型呈趨勢相關，但因樣本量仍較小，也有待更大樣本的分析加以驗證。

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