辣椒抗黃瓜花葉病毒QTL分析

趙 娟 王立浩 毛勝利 張正海 云興福 張寶璽*

（1中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2內蒙古農業大學農學院，內蒙古呼和浩特010019）

近年來，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）對辣椒（Capsicumm annuumL.）的危害日益嚴重，其主要通過蚜蟲進行傳播，可引起辣椒系統花葉、矮化、皺縮，導致果實畸形，嚴重減產（Xu & Barnett，1983）。培育抗黃瓜花葉病毒的辣椒新品種是辣椒育種的目標之一（張寶璽 等，2005）。分子標記技術的成熟為輔助辣椒抗病育種提供了條件，可通過基因定位構建遺傳圖譜，在此基礎上分離克隆抗病基因，進一步了解病害的發生機制（張麗英 等，2008）。

辣椒分子標記和數量遺傳的研究近年逐步發展起來，國外研究者采用RFLP、RAPD、AFLP等分子標記技術得到了一些辣椒抗黃瓜花葉病毒的QTL位點（Caranta et al.，1997；Ben Chaim et al.，2001；Caranta et al.，2002），國內研究者在辣椒抗疫病（安靜 等，2007）、辣椒紅素含量（張芳芳 等，2010）的QTL定位方面取得一定進展。但關于辣椒抗黃瓜花葉病毒QTL定位的研究鮮見報道，本試驗采用SRAP和SSR分子標記技術相結合，構建辣椒分子遺傳圖譜，針對辣椒抗黃瓜花葉病毒基因進行QTL定位分析，以期為今后辣椒抗黃瓜花葉病毒育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試辣椒品種 perennial，抗黃瓜花葉病毒，果實指形，朝天，味辣，從法國農業科學院引進；甜椒品種茄門，感黃瓜花葉病毒，果實燈籠形，主要園藝性狀優良，來自中國農業科學院蔬菜花卉研究所。

試驗于 2008年 3～11月在本所進行。采用抗病材料 perennial和感病材料茄門雜交的 F2為作圖群體，共146株。F2自交得到F3，共146個株系，每個株系3次重復，每處理10株，共4 380株。

2008年3月播種雙親以及F2群體的146個單株；9月播種雙親以及F3株系，每個苗盤種植6行，每行10株，F3每個株系種植30株，以75-3-1為感病對照，進行室內人工接種抗病性鑒定。

1.2 分子標記篩選

采用CTAB小量法（Fulton et al.，1995）提取雙親、F2的146個單株葉片DNA。SRAP分子標記引物參考 Li和 Quiros（2001）、Riaz等（2001）、Lin等（2003）、Budak等（2004）、王剛等（2004）、雷劍和柳俊（2006）等。SRAP擴增反應體系參考 Li和 Quiros（2001）的方法。SSR分子標記引物參照Sol genomics network上公布的引物（http://solgenomics.net/），共150對（上海生工生物工程技術服務有限公司合成），利用親本進行引物的篩選。SSR擴增反應體系參照Tam等（2005）的方法，擴增產物在4%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳、銀染。將銀染后晾干的膠板放置于白光燈箱上，統計多態性條帶，與母本茄門帶型相同記為a，與父本perennial帶型相同記為b，具有共顯性的帶型記為h，由于各種原因造成的數據不清晰或缺失者記為“-”。在SRAP標記中，F2出現與母本不同的記為c，與父本不同的記為d。

1.3 抗病性鑒定

本試驗采用的黃瓜花葉病毒為重花葉株系，該病毒由本所病毒真菌課題組提供。在防蟲溫室中，待幼苗 3～4片真葉時采用人工摩擦接種法（孫秀東 等，2008）進行接種。接種前，要保證幼苗的生長整齊一致。以75-3-1為感病對照。取已感染黃瓜花葉病毒的三生煙（Nicotiana tobacumcv.Samsun NN）鮮葉，按照鮮葉與0.03 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH=8.0）1M∶5V混合。在冰浴中研磨成勻漿，離心過濾得到接種液，接種液現配現用。接種前在辣椒真葉上灑少許過600目篩金剛砂，然后用手指蘸取接種液輕輕摩擦葉面，接種第1、2真葉。接種后用水沖掉葉面上多余的汁液。接種后溫度控制在25～30 ℃。第1次接種3 d后進行第2次接種，保證所有單株均接有該病毒。接種20 d后調查發病癥狀。

病情分級標準參照國家“八五”辣椒抗病育種攻關組的分級標準（李樹德，1995）：0級，無任何癥狀；1級，心葉明脈或接種葉急性小枯斑；3級，系統花葉或莖上產生壞死斑點；5級，系統重花葉、畸形或莖上產生壞死條斑；7級，多數葉片畸形、蕨葉、植株矮化或莖、枝和葉脈系統壞死；9級，植株嚴重矮化，停止生長或嚴重系統壞死，至全株死亡。群體抗病類型劃分標準參考孫秀東等（2008）的方法，免疫（I）：病情指數=0；高抗（HR）：病情指0.1～5.0；抗病（R）：病情指數5.1～20.0；耐病（MR）：病情指數20.1～40.0；感病（S）：病情指數大于40.0。

1.4 數據分析

根據孔繁玲（2006）的世代對比法計算F2群體的廣義遺傳力。結合SRAP和SSR分子標記在 F2上的多態性，采用 JoinMap3.0軟件構建連鎖遺傳圖譜，取 LOD＞3.0。參照 Ben Chaim等（2001）的方法，將遺傳圖譜的數據結合辣椒抗黃瓜花葉病毒的接種鑒定結果，運用MapQTL4.0軟件中的Permutation Test功能，計算并確定連鎖群的LOD值；利用Composite Interval Mapping功能即復合區間作圖法進行QTL分析，并分析QTL的加性效應，解釋表型變異的貢獻率。

2 結果與分析

2.1 SRAP、SSR分子標記多態性

篩選出有差異的SRAP引物426對，選擇擴增多態性譜帶較清晰，且在父母本間表現差異明顯的SRAP引物35對，在F2群體上進行DNA多態性分析，得到83個多態性標記，平均每對引物可以擴增出 2條明顯的差異譜帶。其中引物Bm8F×K2R在 F2群體上部分單株的多態性見圖1。

圖1 引物Bm8F×K2R在F2群體上的多態性分析

篩選出有差異的SSR引物56對，選擇擴增多態性譜帶較清晰，且在父母本間表現差異明顯的SSR引物36對，在F2群體上進行DNA多態性分析。其中引物SSR088在F2群體上部分單株的多態性見圖2。

2.2 抗黃瓜花葉病毒鑒定結果

從 F3群體的表現來看，各株系間差異明顯（圖3）。父本perennial整體無明顯感病癥狀，僅個別葉片上產生枯斑；母本茄門感病癥狀明顯，出現花葉、矮化、條斑，部分單株甚至死亡；F1的感病癥狀介于親本之間，有枯斑和花葉出現（圖4）。

圖2 引物SSR088在F2群體上的多態性分析

圖3 F3群體接種黃瓜花葉病毒的發病情況

圖4 父母本及F1接種黃瓜花葉病毒的發病情況

將F3群體抗病鑒定的病情指數取平均值來反映F2世代146個單株的抗病性（Ben Chaim et al.，2001），就是利用擴大接種鑒定的群體數量來提高鑒定F2抗性的準確性。經統計，F3群體中沒有對黃瓜花葉病毒免疫的株系，病情指數在5.1～20.0之間的抗病（R）株系25個，病情指數在20.1～40.0之間的耐病（MR）株系109個，病情指數大于 40.0的感病（S）株系 12個。其中父本perennial的病情指數為4.44，是對CMV高抗的品種，而母本茄門和感病對照75-3-1的病情指數分別為51.11、59.84，均遠大于40.0。

由圖5可以看出，F3株系抗黃瓜花葉病毒病情指數分布呈正態分布，可用于數量性狀的定位分析。

圖5 F3株系抗黃瓜花葉病毒病情指數分布圖

2.3 廣義遺傳力分析

如表1所示，辣椒抗黃瓜花葉病毒病的廣義遺傳力不高，僅為 45.47%，說明抗性可能受到多個基因控制，同時環境因素對黃瓜花葉病毒病的抗性表現有較大影響，在進行抗病育種時應放寬選擇標準。

表1 F2的廣義遺傳力

2.4 分子遺傳圖譜和QTL定位

利用SRAP分子標記得到83個多態性標記，結合36個SSR多態性標記，應用JoinMap3.0軟件進行連鎖分析，取LOD值為3.0，得到的分子連鎖圖譜包括13個連鎖群、76個標記位點，其中SRAP標記55個，SSR標記21個。圖譜覆蓋長度為830.4 cM，標記間平均圖距為10.92 cM，連鎖群上的標記數在2～16之間，長度處于0～152.2 cM范圍內（圖6）。經QTL分析，在第1、4、7連鎖群上檢測到3個QTL位點（表2）。第1連鎖群上的QTL位點的LOD值為3.78，在連鎖群上支持的區域為136.1～146.1 cM，與其距離最近的兩個標記是C9C10-4、B11C16-2，可解釋表型差異的貢獻率為12.7%；在第4連鎖群上的QTL位點LOD值為3.35，在連鎖群上支持的區域為57.0～62.0 cM，與其距離最近的標記為B13C10、HpmsE072；在第7連鎖群上檢測到的QTL位點在HpmsE124和hpms2-2兩個標記之間，其LOD值為3.73，支持區域為94.3～109.3 cM；后2個QTL的解釋表型差異的貢獻率分別為38.8%和11.0%。

圖6 辣椒抗黃瓜花葉病毒分子遺傳連鎖圖譜

表2 辣椒抗黃瓜花葉病毒QTL分析

3 結論與討論

國外對于辣椒抗黃瓜花葉病毒的QTL定位的研究取得了一些成果。Caranta等（1997）通過構建辣椒遺傳圖譜結合對F1抗病性鑒定，找到3個有關辣椒抗CMV的QTL位點，解釋的表型變異在57%以上。之后又利用復合區間作圖法在新的親本組合中找到8個抗CMV的QTL位點，其中1個主效QTL解釋的表型變異為45.0%～63.6%（Carahta et al.，2002）。Ben Chaim等（2001）在由180個F3世代單株為作圖群體構建辣椒遺傳圖譜的基礎上，采用區間作圖法對辣椒抗CMV進行定位研究，得到4個QTL位點，其中1個主效QTL解釋的表型變異為16%～33%。

本試驗采用復合區間作圖法得到3個QTL位點，分布在3個連鎖群上，能解釋表型變異率分別為 12.7%、38.8%和 11.0%。與第 1個 QTL位點距離較近的標記是 C9C10-4、B11C16-2，與第2個QTL位點距離較近的標記是B13C10、HpmsE072，與第3個QTL位點距離較近的標記是HpmsE124、hpms2-2，在這6個標記中，HpmsE072、HpmsE124和hpms2-2屬于SSR標記。通過對本試驗中構建的辣椒遺傳圖譜的第 7連鎖群、Lee等（2004）構建的辣椒遺傳圖譜的第11連鎖群、已公布（http：//solgenomics.net/）的辣椒第10和第11條染色體DNA序列、Ben Chaim等（2001）構建的辣椒抗CMV遺傳圖譜的第11連鎖群上的標記進行比較分析發現，可以通過其上的標記將本試驗定位的第3個QTL位點與Ben Chaim等（2001）定位的主效QTL位點cmv11.1聯系起來。說明本試驗定位的QTL位點有可能與Ben Chaim等（2001）定位的QTL位點是同一位點，也可能是同一連鎖群上的不同抗CMV位點。這需要進一步加密遺傳圖譜，尋找更多的抗CMV位點。

本試驗中得到3個QTL位點的LOD值分別為3.78、3.35、3.73，QTL數量較少，可能與標記數量偏少和圖譜密度不夠有關，有待于進一步增加新的標記，豐富遺傳圖譜。

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