黑龍江省瓜類白粉病菌IGS-RFLP分析

魏尊苗 王學征 高 鵬 欒非時

（東北農業大學園藝學院，黑龍江哈爾濱 150030）

白粉病是一種廣泛發生的世界性病害，在甜瓜、西瓜、黃瓜、南瓜等葫蘆科作物上均可嚴重發生。單絲殼白粉菌Podosphaera xanthii（原用名Sphaerotheca fuliginea）和二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum（原用名Erysiphe cichoracearum）（Cohen et al.，2004）是瓜類白粉病的主要病原菌（Davis et al.，2002），P. xanthii分化為11個生理小種，分別為小種0、1、2US、2France、3、4、5、N1、N2、N3 和 N4（Vakalounakis et al.，1994）；G. cichoracearum分化為 2個生理小種（James & Creight，2002），分別為小種0和小種1。白粉病菌的種類多、分布廣、形態特征復雜，傳統的形態特征分類方法常引起諸多意見分歧。與傳統鑒別寄主鑒定白粉病菌生理小種相比，利用分子生物學手段鑒定白粉病菌可以克服很多外界因素，使結果更科學準確。

核糖體DNA（rDNA）的編碼區序列具有保守性而非編碼區變異豐富，分析真菌核糖體基因是進行真菌分類鑒定和系統發育的有效方法（Bruns et al.，1991）。rDNA基因間隔區（IGS，intergenic spacer）被認為是rDNA中變異最快的區域（Paule & Lofquist，1996），是檢測真菌種群或個體間遺傳關系的有效變異序列，是真菌屬內種間比較和種內變種遺傳多樣性分析的重要分子標記（Sugita et al.，2001）。近年來已逐漸用于微生物種水平以下的鑒定、分類，Sugita等（2003）利用IGS測序鑒定菌株并研究其親緣關系；張金霞等（2004）、黃晨陽等（2005）利用IGS-RFLP對側耳菌株進行鑒別；Bunyard等（1996）研究了栽培種雙孢蘑菇、香菇和平菇的IGS，結果表明各個栽培種內不同菌株的IGS有豐富的多態性。應用 IGS-RFLP對瓜類白粉病菌菌株進行遺傳學分析和菌株鑒定尚未見報道，本試驗目的在于應用分子生物學技術對黑龍江省瓜類白粉病菌進行遺傳多樣性研究，在DNA水平上分析白粉病菌菌株的基因遺傳學差異，以期對白粉病菌的鑒定提供穩定快速有效的技術方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

于葫蘆科作物白粉病盛發期（2010年7月中下旬）在黑龍江省的哈爾濱、綏化、齊齊哈爾、牡丹江、大慶、雙鴨山、鶴崗、黑河、加格達奇 9個主要生態區不同設施不同寄主上采集新鮮感病嚴重的瓜類白粉病病葉。將采集菌株隔離保存，接種到感病植株上進行純化，收集純化白粉病菌于1.5 mL EP管中，置于-20 ℃冰箱中保存，以備提取 DNA，進行 IGS分析。供試菌株的生理小種類型由東北農業大學西甜瓜分子育種實驗室鑒定（待發表）。分離純化有代表性的16份菌株見表1。

1.2 白粉病菌菌株DNA的提取與檢測

采用CTAB法（羅瓊，2002）提取白粉病菌菌株DNA，研磨前在裝有白粉病菌的EP管中放少許滅過菌的石英砂，有利于研磨。用1%瓊脂糖檢測DNA質量，將提取質量合格的DNA置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 白粉病菌菌株的IGS-PCR擴增與酶切

擴增體系：dNTP（2.5 mmol·Leach-1）2 μL，Primer各 1 μL（表2），ExTaqTMDNA polymerase 1 U，10×PCR buffer（mg2+）2.5 μL，DNA 模板 1 μL，用 ddH2O補齊至 25 μL。

表1 供試白粉病菌菌株

IGS-PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃變性12 min，60 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃補齊7 min，4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳1 h，置于凝膠成像系統照相記錄結果。

本試驗采用 3種快速限制性內切酶，即MspⅠ、AsuⅠ、Hinp1Ⅰ（由 Fermentas公司提供）。15 μL 酶切反應體系：2 μL PCR 產物，1 μL 10×buffer，0.2 μL內切酶，6.8 μL無菌去離子水。反應體系：37 ℃，10 min。

表2 IGS1、IGS2擴增反應的引物

1.4 電泳檢測與數據分析

以100 bp DNA ladder Mark er（TransGen Biotech）為分子量對照，取5 μL PCR產物在2.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，經EB染色后，拍照記錄圖譜。電泳圖譜中的每一條帶均作為1個位點，按Nei和Li（1979）提出的方法記錄酶切圖譜上同一分子量處條帶的有無，有條帶者記為“1”，無則為“0”，制成0-1矩陣表用于數據處理。利用NTSYS-PC軟件采用平均連鎖法（UPGMA）進行聚類分析，自動生成遺傳相似系數矩陣和樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 DNA的提取

采用CTAB法提取各菌株的總DNA，成功提取了16份白粉病菌的DNA，用1%含有EB的瓊脂糖凝膠對16個菌株DNA樣品進行電泳，結果所檢測樣本的DNA均無降解，無雜質，適合IGS擴增，如圖1所示。

圖1 16個白粉病菌菌株DNA

2.2 IGS-RFLP分析

IGS1擴增結果表明，兩對 IGS1引物擴增結果相似，供試菌株間 IGS1片段大小和數量存在豐富的多態性，不同菌株間 IGS1片段的數量存在顯著差異，除菌株md和菌株qq擴增出一條帶外，其他菌株均為多條，片段長度在500～2 000 bp之間，供試菌株中有12株擴增出了IGS1片段（圖2）。

IGS2擴增結果表明，供試菌株間IGS2亦存在較大差異但多態性較IGS1低，擴增條帶數在1～4條之間，片段大小多在2 000 bp左右，較IGS1長。IGS1與IGS2均未發現小種間特異片段，供試菌株中只有8株擴增出了IGS2片段（圖3）。

圖2 供試菌株IGS1擴增圖譜

應用MspⅠ、AsuⅠ、Hinp1Ⅰ3個限制性內切酶對供試菌株的IGS1和IGS2片段進行酶切，結果顯示每個菌株的IGS1和IGS2均存在3個內切酶的酶切位點，不同菌株電泳后產生不同的帶型圖譜，呈現豐富的多態性，成為樣本特有的DNA指紋，但并未發現小種間特異片段。以IGS1MspⅠ酶切圖譜為例，如圖4所示。

圖3 部分供試菌株IGS2擴增圖譜

圖4 供試菌株IGS1 MspⅠ酶切圖譜

2.3 IGS1-RFLP聚類分析

用NTSYS-PC軟件對其中酶切效果好的10個菌株IGS1-RFLP圖譜進行分析，計算菌株的遺傳相似系數，根據遺傳相似系數用UPGMA法進行聚類分析，菌株遺傳相似系數在0.460 0～0.800 0之間（表3），說明黑龍江省瓜類白粉病菌存在較豐富的遺傳多樣性，其中來自哈爾濱的菌株 hr-1與菌株 hr-2遺傳相似系數最大，為0.80；來自鶴崗的菌株 hg與來自哈爾濱的菌株hr-3遺傳相似系數最小，為0.460 0。以遺傳相似系數0.60為閾值，可將供試菌株分為3類（圖5）。

同為生理小種N1的菌株hg與菌株md遺傳相似系數比較小，為0.52，分別被聚到了第Ⅲ類和第Ⅰ類，其他均為生理小種1的菌株被分別聚到了第Ⅰ類、第Ⅱ類和第Ⅲ類，相同菌株并未完全聚為一類，因生理小種的劃分基于白粉病菌對鑒別寄主的致病性，由此可知白粉病菌群體基因型與致病性之間有一定相關性但不呈一一對應關系。

從寄主上看，第Ⅰ類包括甜瓜、黃瓜和西瓜，第Ⅱ類包括南瓜和甜瓜，第Ⅲ類只包含一個菌株，其寄主為黃瓜，初步確定供試白粉病菌群體基因型的劃分與寄主來源不直接相關；從地域上看，來自鶴崗的hg菌株單獨聚為第Ⅲ類；來自哈爾濱的菌株hr-4、佳木斯的菌株jm和齊齊哈爾的菌株qq聚為第Ⅱ類；其他菌株聚到第Ⅰ類。相同或相近地區的白粉病菌并未完全聚到一起，可知白粉病菌群體基因型的劃分與菌株地理來源無直接關系。從設施上看第Ⅰ類包括大棚和溫室，第Ⅱ類包括露地和溫室，第Ⅲ類只包含一個菌株，其設施為大棚，可見白粉病菌群體基因型的劃分與菌株來源設施類型之間無直接關系。

圖5 10個白粉病菌基于IGS-RFLP分子標記

表3 10個供試菌株的遺傳相似系數矩陣

3 結論與討論

本試驗應用 IGS-RFLP分析對黑龍江省瓜類白粉病菌進行遺傳多樣性研究和菌株鑒別，應用真菌IGS通用引物對黑龍江省瓜類白粉病菌進行擴增，菌株間表現出豐富的多態性，IGS1擴增片段長度較IGS2擴增片段小，但是多態性較IGS2高，采用3種快速限制性內切酶對白粉菌的IGS1和IGS2擴增產物進行酶切，結果顯示均具良好的穩定性和可重復性，酶切圖譜具豐富的多態性，菌株間有顯著差異，IGS-RFLP可以將供試菌株有效地進行鑒別，但未發現小種間的特異片段，還有待進一步的研究。通過對IGS1-RFLP酶切圖譜聚類分析，可知菌株間的相似系數在0.460 0～0.800 0之間，說明黑龍江省瓜類白粉病菌具有豐富的遺傳多樣性，與IGS擴增結果一致；本試驗初步確定葫蘆科白粉病菌致病性與DNA多態性不形成一一對應關系；菌株的遺傳多樣性與菌株地理來源、寄主來源及設施類型未呈現明顯的相關性。此類結果的研究報道很多，段會軍等（2007）對河北省西瓜枯萎病生理小種鑒定并進行AFLP分析，結果顯示AFLP類群劃分與致病性鑒定劃分的生理小種之間存在一定相關性，但與菌株的地理來源無關；del Pino等（2002）認為西班牙葫蘆科白粉病菌小種與致病性間沒有明顯相關性；Valerio等（2005）用RAPD和RFLP兩種方法分析大麥炭疽病菌，發現致病性與分子標記之間沒有相關性。

IGS中含有許多重復序列或亞重復序列，在有絲分裂時經常發生不均等交換，單位重復數目的變化造成IGS長度的變異（Martin et al.，1999），這種變異在電泳中表現為遷移率的不同，呈現多個條帶。不同菌株的重復序列或亞重復序列的數量不同，造成了其長度異質性（Albee et al.，2006）。RFLP的產生是由于點突變，DNA的重排、插入或缺失引起的，利用RFLP進行分類鑒定時的一個重要問題就是根據不同的分類水平（屬、種、株）研究選擇不同的 DNA片段（Goodwin et al.，1992）。真菌的遺傳學研究表明，幾乎所有的擔子菌IGS2比IGS1區長，變異性大，進化較快，可用于種間和種內遺傳多樣性研究，但本試驗所測黑龍江省葫蘆科瓜類白粉病菌的IGS區序列卻不完全相同，IGS2區長于IGS1區，但IGS1區多態性更強，這和梁宏等（2006）的研究結果相同。

在對不同菌株的 IGS區的擴增過程中，大部分菌株均可得到成功擴增，但是也有部分菌株IGS2擴增不出來，雖然在實驗過程中對PCR反應條件進行了一系列的調整，但是這些菌株仍擴增不出來，這與代玉梅等（2004）、岳海梅等（2010）對IGS區的研究結果一致，說明目前使用的PCR通用引物還不夠保守，未必適合所有菌株，如果能有針對性的設計引物應該可以有更好的效果。取樣過程中每一個菌樣盡量多收集菌株以保證實驗順利進行，本試驗只對黑龍江省瓜類白粉病菌進行了研究，如能擴大取樣范圍則更具有代表性且有說服力。

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