卡泊芬凈對生物膜態白色念珠菌體外抑菌作用的試驗研究Δ

陽雋，張天托，朱家馨（1.廣州醫學院第二附屬醫院呼吸內科，廣州市51060；.中山大學第三附屬醫院呼吸內科，廣州市 510630）

近年來隨著臨床上廣譜抗菌藥物的大量使用及侵入性治療的開展，念珠菌感染呈增多趨勢。白色念珠菌可在黏膜及各類導管支架的表面形成生物膜，生物膜是一種由融合的基底芽生孢子層、菌絲成分和細胞外多聚基質3部分組成的結構群體，可以逃避宿主免疫作用，具有極強的耐藥性。生物膜態白色念珠菌相關感染是臨床治療上的難點。卡泊芬凈是一種新型的棘白菌素類抗真菌藥物，作用機制為抑制β-（1，3）-D-葡聚糖的合成，體外研究[1～4]顯示卡泊芬凈對生物膜態白色念珠菌有抑制作用，但對于卡泊芬凈的有效濃度各實驗室報道不一。因此，本研究選取了10株已證實的可黏附生長形成生物膜態白色念珠菌的臨床分離株，分別檢測卡泊芬凈對生物膜態白色念珠菌的抑菌作用，以探討臨床治療生物膜態白色念珠菌相關感染的最適治療劑量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TE2000U倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ELX800全自動酶標儀（美國BioTek公司）；EVO 50電子顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2 藥品

注射用醋酸卡泊芬凈（以下簡稱卡泊芬凈，美國默克公司，批號：J6253，規格：每支50 mg）。

1.3 菌株

白色念珠菌臨床分離株均分離自中山大學第三附屬醫院呼吸實驗室收集的臨床痰液標本，試驗共收集了54株，并篩選出10株黏附生長明顯、能形成典型生物膜態白色念珠菌的菌株進行藥敏試驗，菌株編號為 13860、13874、13879、14215、14813、15086、15346、15538、16308、16335。質控菌株：白色念珠菌（ATCC90 028、ATCC64 550）由中山大學第三附屬醫院呼吸實驗室保存。

1.4 培養基

科瑪嘉念珠菌顯色培養基（法國CHROMagar公司產品，批號：100517）、沙堡氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號：100608）均由廣東江門凱林貿易有限公司提供；RPMI1640培養基（美國Gibco公司，批號：785914）。

2 方法

2.1 貯備液的制備

取卡泊芬凈適量，用滅菌水溶解，并稀釋成濃度10 mg·mL－1貯備液，于－20℃分裝保存，備用。

2.2 菌株的鑒定與保存

取臨床分離株經科瑪嘉念珠菌顯色培養基及芽管實驗鑒定為白色念珠菌，將鑒定分純的白色念珠菌單個菌落接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（YPD，組成：1%酵母浸出粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖），振蕩培養過夜，取菌液800μL與滅菌甘油200μL充分混勻，放置于－70℃冰箱保存，備用。

2.3 生物膜態白色念珠菌的形成

取出凍存的白色念珠菌接種于SDA平板，置于CO2恒溫培養箱中，37℃培養24 h，挑取平板上生長的白色念珠菌單個菌落接種于YPD中，30℃振蕩培養24 h，離心收集菌體，0.1 mol·L－1磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2次，加入RPMI1640培養基調節菌液濃度為1×106個/L，接種于放置有20 mm×20 mm聚乙烯細胞爬片的6孔細胞培養板中，于CO2恒溫培養箱中37℃培養24 h，PBS漂洗2次，洗去未黏附菌細胞，置于倒置顯微鏡下觀察生物膜態白色念珠菌的結構。另將PBS漂洗后的細胞爬片于2%戊二醛中固定3 h，PBS漂洗3次，每次15 min，再用50%、70%、80%、90%、95%乙醇逐級脫水，各15 min，然后換叔丁醇脫水15 min，經臨界點干燥鍍膜處理后于電子顯微鏡下觀察生物膜態白色念珠菌的結構。

2.4 游離態白色念珠菌藥敏試驗

選用美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）M27-A方案的微量液體稀釋法，采用倍比稀釋法稀釋藥液，取卡泊芬凈貯備液用RPMI1640培養基稀釋至濃度為0.063～32 mg·L－1作為試驗孔，并設立不含藥物的陽性對照和無菌培養基空白對照。加入白色念珠菌（即游離態白色念珠菌）或質控菌株35℃培養48 h后，于酶標儀520 nm波長處測定各孔吸光度（A），并計算Y值＝（各試驗孔A值－空白對照A值）/陽性對照A值，Y值越大，白色念珠菌的增殖活性越強。當Y值＜0.5時的最低卡泊芬凈濃度即為半數抑菌濃度（MIC50），試驗設3個復孔。

2.5 生物膜態白色念珠菌藥敏試驗

[5]報道的方法進行，將白色念珠菌接種于96孔細胞培養板上黏附生長24 h，PBS漂洗3次，去除未黏附菌細胞。加入用RPMI1640培養基倍比稀釋的卡泊芬凈，濃度為0.25～256 mg·L－1[4]作為試驗孔，并設立不含藥物的陽性對照。35℃培養48 h，采用四唑鹽（XTT）減低法檢測菌細胞增殖活性，于酶標儀490 nm波長處測定各孔吸光度，每株菌取4個復孔檢測，取其平均值，并計算Y值＝各試驗孔A值/陽性對照A值，Y值越大，白色念珠菌的增殖活性越強。當Y值＜0.5時的最低卡泊芬凈濃度為MIC50。

3 結果

3.1 生物膜態白色念珠菌的結構

白色念珠菌分離株可在聚乙烯細胞爬片上黏附生長形成生物膜。倒置顯微鏡下可見生物膜態白色念珠菌主要由菌絲細胞構成，間有孢子，具體見圖1；電子顯微鏡下可見生物膜態白色念珠菌具有菌絲交錯的三維立體空間結構，具體見圖2。

3.2 游離態白色念珠菌藥敏試驗結果

圖1 倒置顯微鏡下生物膜態白色念珠菌結構圖（20×10）Fig 1 Inverted microscope image of Candida albicans biofilm（20×10）

圖2 電鏡下生物膜態白色念珠菌結構圖（×3 000）Fig 2 SEM image of Candida albicans biofilm（×3 000）

卡泊芬凈對10株游離態白色念珠菌及質控菌株的MIC50為0.125～0.5 mg·L－1，MIC50中位數為0.25 mg·L－1。當卡泊芬凈濃度高于游離態白色念珠菌MIC50時，10株游離態白色念珠菌的增殖活性幾乎完全受到抑制。卡泊芬凈對10株游離態白色念珠菌的MIC50值詳見表1。不同濃度卡泊芬凈作用下游離態白色念珠菌的增殖活性比較見圖3。

圖3 不同濃度卡泊芬凈作用下游離態白色念珠菌的增殖活性比較Fig 3 Metabolic activity of planktonic cells of C.albicans at different concentrations of caspofungin

3.3 生物膜態白色念珠菌藥敏試驗結果

結果表明，卡泊芬凈對10株生物膜態白色念珠菌的MIC50為 0.25～256 mg·L－1，其中有 8株生物膜態白色念珠菌MIC50≤2 mg·L－1，MIC50中位數為1 mg·L－1。當卡泊芬凈濃度高于生物膜態白色念珠菌MIC50時，有7株生物膜態白色念珠菌（編號13860、13879、14813、15086、15538、16308、16335）的增殖活性再次增強，且大于陽性對照的50%。卡泊芬凈對10株生物膜態白色念珠菌的MIC50值詳見表1。不同濃度卡泊芬凈作用下生物膜態白色念珠菌的增殖活性比較見圖4。

表1 卡泊芬凈對游離態及生物膜態白色念珠菌的MIC50值Tab 1 MIC50of caspofungin against planktonic cells and biofilm-associated adherent cells of Candida albicans

圖4 不同濃度卡泊芬凈作用下生物膜態白色念珠菌的增殖活性比較Fig 4 Metabolic activity of biofiom cells of C.albicans at different concentrations of caspofungin

4 討論

本研究結果顯示，10株游離態白色念珠菌對卡泊芬凈敏感，MIC50為0.125～0.5 mg·L－1，而治療劑量的卡泊芬凈靜脈滴注，平均血藥濃度為12.4 mg·L－1，24 h后為1.42 mg·L－1[6]，提示體內卡泊芬凈對游離態白色念珠菌具有良好的抗菌作用。

卡泊芬凈對10株生物膜態白色念珠菌的MIC50為0.25～256 mg·L－1，其中8株≤2 mg·L－1，表明臨床治療劑量的卡泊芬凈對大部分生物膜態白色念珠菌有抑菌作用。但有研究[1～4]報道卡泊芬凈對生物膜態白色念珠菌的有效濃度差異較大，考慮可能與所用菌株不同相關。本研究結果顯示，當卡泊芬凈濃度高于生物膜態白色念珠菌MIC50時，有7株生物膜態白色念珠菌的增殖活性再次增強，而更高濃度的卡泊芬凈（256 mg·L－1）對生物膜態白色念珠菌的抑菌作用有再次增高趨勢，與國外文獻報道基本一致[7，8]，但其可能機制目前尚不明確。

綜上所述，臨床治療劑量的卡泊芬凈對游離態白色念珠菌有良好的抑菌作用，對生物膜態白色念珠菌也有抑菌作用，但不呈濃度依賴性，當其濃度高于MIC50時抑菌作用出現下降現象，此現象對臨床治療的影響目前尚不清楚。在將其用于治療生物膜態白色念珠菌相關感染時，最適治療劑量有待臨床研究驗證。

參考文獻

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