氯沙坦對進展性腎炎模型大鼠腎小管-間質細胞巨噬細胞移動抑制因子的影響研究Δ

查艷，趙盈葶，楊霞，陳運芬，俞雷（.貴州省人民醫院腎內科，貴陽市550004；2.貴州省電力醫院，貴陽市 550004）

氯沙坦（Losartan）是血管緊張素Ⅱ受體1型拮抗藥，具有降壓和減少尿蛋白的療效[1]；但其抑制腎小管-間質炎癥反應，從而保護腎功能的具體機制目前尚不完全清楚。巨噬細胞（巨噬細胞標記抗原ED-1+的細胞）作為腎組織的主要炎癥浸潤細胞存在于許多原發和繼發性腎臟疾病中，巨噬細胞移動抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）與腎臟組織學損害、蛋白尿程度及腎功能衰退密切相關[2，3]。因此，筆者在進展性腎炎（Progressive nephritis）大鼠模型[4]中，觀察腎小管-間質細胞MIF的表達與間質炎癥的相關性，以及給予不同劑量氯沙坦干預后MIF在腎小管-間質細胞中表達的變化，探討氯沙坦是否可以通過調節MIF的表達來改善腎小管-間質的炎癥反應。

1 儀器與材料

1.1 儀器

全自動多功能生化分析儀（日本Hitachi公司）；SN-628放射免疫γ計數儀（中國科學院上海原子核研究所）；光學顯微鏡、C3040-ADU顯微圖像分析系統（日本Olympus公司）；LE5001鼠尾無創血壓測量儀（美國普升科技有限公司）。

1.2 試藥

氯沙坦片（杭州默沙東制藥公司，批號：100576，規格：每片50 mg）；小鼠抗大鼠MIF抗體、小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體、鼠單克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗體（IgG（OX-7）mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody）、正常山羊血清（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；LSAB免疫組織化學（組化）試劑盒（丹麥Dako公司）。

1.3 動物

Wistar大鼠，♂，體重（126.7±10）g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，二級，合格證號：SCXK（渝）2007-0005。

2 方法

2.1 建模與給藥[5]

取大鼠行右腎切除并注射鼠單克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗體2次建立進展性腎炎大鼠模型，于第4周時取部分大鼠立即處死作為模型組，將剩余模型大鼠分為對照組和氯沙坦高、低劑量組（80、20 mg·kg－1·d－1），再另取大鼠行假手術作為假手術組，每組5只，連續給藥4周。實驗第8周時在麻醉狀態下處死剩余所有大鼠，取左腎標本，于－70℃冰箱保存。

2.2 觀察指標

2.2.1 MIF、ED-1的免疫組化染色。取10%中性甲醛固定的3μm厚石蠟腎組織切片，常規脫蠟、水化；浸入3%H2O210 min除去內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次3～5 min；微波修復抗原，PBS洗3次，每次3～5 min；正常山羊血清封閉10 min，PBS洗3次，每次3～5 min；滴加稀釋的一抗鼠單克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗體（1∶100，V/V），4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3～5 min；分別滴加小鼠抗大鼠MIF抗體及小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體（1∶50），室溫孵育30 min；二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素輕度復染，以PBS洗3次，每次3～5 min，脫水，透明，封片。檢測采用顯微圖像分析系統對各組染色結果進行積分光密度（IOD）測定，每張切片隨機選取10個高倍視野（400倍），每個視野代表0.13 mm2的區域面積，計算其IOD，取平均值作為MIF、ED-1的表達情況。

2.2.2 MIF和ED-1在同一個細胞內的表達檢測。采用微波免疫組化雙重染色檢測，取對照組腎組織切片，第1重染色同“2.2.1”項下“常規脫蠟……4℃過夜，PBS洗3次，每次3～5 min”操作，再滴加小鼠抗大鼠MIF抗體（1∶100稀釋），DAB顯色，陽性物呈棕色。完成第1重染色后將切片浸人0.01 mmol·L－1、pH6.0的枸櫞酸緩沖液中置微波爐加熱（800 W）10 min，自然冷卻至室溫后用PBS洗滌，接著用巨核細胞酶標染色（APAAP）法行第2重染色，滴加小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體（1∶500稀釋），再孵育、顯色、沖洗后觀察陽性物呈紫藍色。

2.3 統計學處理

采用SPSS 11.3統計軟件進行分析。數據用均數±標準差表示，多組均數的比較采用單因素方差分析。相關分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 MIF、ED-1的免疫組化檢測結果

3.1.1 MIF的表達。結果表明，假手術組MIF幾乎無表達，與其比較，模型組和對照組MIF表達顯著升高（P＜0.001），主要集中在腎小管-間質細胞的胞漿。與模型組和對照組比較，氯沙坦高、低劑量組MIF表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。具體指標詳見表1。切片圖見圖1。

表1 各組大鼠MIF、ED-1表達比較（±s，n＝5）Tab 1 Comparison of MIF and ED-1 in each group（±s，n＝5）

表1 各組大鼠MIF、ED-1表達比較（±s，n＝5）Tab 1 Comparison of MIF and ED-1 in each group（±s，n＝5）

與假手術組比較：＊P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.01，##P＜0.001；與對照組比較：ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.001vs.sham operation group：＊P＜0.001；vs.model group：#P＜0.01，##P＜0.001；vs.control group：ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.001

指標MIF/×103 ED-1/×103假手術組1.81±0.24 1.64±0.13模型組54.28±5.64＊27.96±4.15＊對照組58.79±6.02＊31.47±4.09＊氯沙坦低劑量組24.05±3.18#Δ 4.16±0.52##ΔΔ氯沙坦高劑量組22.64±3.46#Δ 2.32±0.19##ΔΔ

圖1 各組大鼠腎組織MIF和ED-1表達的切片圖（×200）Fig 1 Slice map of MIF and ED-1 expression of kinedy tissue in each grou（p×200）

3.1.2 ED-1的表達。結果表明，假手術組ED-1幾乎無表達，與其比較，模型組和對照組ED-1表達顯著升高（P＜0.001），主要集中在腎小管-間質細胞的胞漿。與模型組和對照組比較，氯沙坦高、低劑量組ED-1表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。具體指標詳見表1。切片圖見圖1。

3.2 MIF和ED-1在同一個細胞內的表達檢測結果

MIF（棕色）和ED-1（藍紫色）同時顯色在腎小管-間質細胞的胞漿見圖2。

4 討論

MIF蛋白含114個氨基酸，由α鏈和β鏈組成三維晶體結構，其不僅主要由巨噬細胞產生，而且可作用于巨噬細胞，引起巨噬細胞在局部浸潤、增生以及刺激巨噬細胞分泌多種細胞因子[6]。MIF的主要生物效應是抑制巨噬細胞的游走，促進巨噬細胞在炎癥局部的聚集、增生、活化及分泌一些細胞因子如（白介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α），增強炎癥反應程度。有研究[7]發現在給大白兔注射腎毒血清的同時腹腔注射抗MIF中和抗體，能有效防止腎組織損害的發生、發展。但MIF在進展性腎炎中的作用及是否能夠通過阻斷MIF的表達而減輕腎小管間質進行性損害尚未見文獻報道。

圖2 MIF和ED-1表達在腎小管-間質同一個細胞的切片圖（×400）Fig 2 Slice map of MIF and ED-1 expression in same tubulointerstitial cell（×400）

本實驗采用免疫組化染色，發現MIF、ED-1在假手術組的腎小管-間質細胞中幾乎不表達，在模型組和對照組的腎小管-間質細胞表達明顯升高（P＜0.001）。為了檢測MIF是否能抑制ED-1向其他組織擴散，本實驗采用雙重免疫組化染色檢測了MIF與ED-1是否在同一個細胞內表達，結果表明MIF和ED-1同時顯色于同一個細胞的胞漿。這與既往的報道[6]相一致。經過不同劑量氯沙坦治療4周后，進展性腎炎模型大鼠腎小管-間質炎癥反應明顯改善，MIF和ED-1表達明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）。有研究[8]提示，MIF可以刺激巨噬細胞增生、活化及分泌TNF-α等細胞因子；反過來，TNF-α也可以刺激MIF表達的上調，引起組織學損害。氯沙坦可能通過下調TNF-α的表達，從而抑制了MIF和ED-1在進展性腎炎模型大鼠腎小管-間質細胞中的表達和聚集。其具體的作用機制有待于進一步的探討。

腎小管-間質細胞的炎癥反應也是進展性腎炎的一個主要表現，是預測腎功能下降的重要標志。通過應用氯沙坦抑制腎小管-間質細胞中MIF的表達，可能是早期控制炎癥反應，進而防治腎間質纖維化的重要途徑之一。

[1] 朱俊峰，鄭金聰，劉茂伯.替米沙坦和氯沙坦治療高血壓的Meta分析[J].中國藥房，2008，19（29）：2 287.

[2]Nakima K，Tanaka Y，Nomiyama T，et al.RANTES promoter genotype is associated with diabetic nephropathy in type 2 diabetic subjects[J].Diabetes Care，2003，26（3）：892.

[3] 孔耀中，黃英偉.巨噬細胞移動抑制因子在原發性腎小球腎炎組織中的表達和意義[J].中華腎臟病雜志，2000，12（16）：383.

[4] Matsumoto M.Hypoperfusion of peritubular capillaries induces chronic hypoxia before progression of tubulointerstitial injury in a progressive model of rat glomerulonephritis[J].J Am Soc Nephrol，2004，15（6）：1 574.

[5] 查 艷，何平紅，龍艷君，等.氯沙坦對進展性腎炎模型大鼠腎小管-間質細胞低氧誘導因子及結締組織生長因子的影響研究[J].中國藥房，2011，22（29）：2 711.

[6] Rice E，Tesch G，Mark S，et al.Induction of MIF synthesis and secretion by tubular epithelial cells：a novel action of angiotonsin Ⅱ[J].Kidney Int，2006，63（4）：1 265.

[7] Foote A，Brlganti EM，Kipen Y，et al.Macmphage migration inhibitory factor in systemic lupus erythematosus[J].J Rheumatol，2009，62（7）：268.

[8] Lan HY，Yang N，Hui W，et al.TNF-alpha up-regulates renal MIF expression in rat cresentic glomerulonephritis[J].Mal Med，2008，52（3）：136.