HPLC 法測定復方伐地那非噴霧劑中鹽酸伐地那非的含量

晏亦林，葉勇，張健泓（.廣東食品藥品職業學院，廣州市5050；.廣西醫科大學，南寧市5300）

鹽酸伐地那非是一種新型的治療男性勃起功能障礙（Erectile dysfunction，ED）的高選擇性口服磷酸二酯酶5（PDE5）抑制劑，持續口服可改善陰莖血管內皮功能達到治愈ED的目的[1]，其機制是通過抑制PDE5維持環磷酸鳥苷（cGMP）的高水平，導致陰莖海綿體平滑肌松弛舒張而引發勃起[2]。2003年美國食品與藥品管理局（FDA）正式批準伐地那非作為ED的治療藥物上市，是繼西地那非之后第2個上市的PDE5抑制劑。在其療效得到廣泛驗證的同時，其安全性和耐受性也一直是人們關注的焦點。文獻[3]報道，鹽酸伐地那非存在口服后出現心肌梗死、腦出血、陰莖異常勃起、陰莖纖維化、嚴重者致死亡等不良反應的可能。為增強療效，減少不良反應，方便患者用藥，筆者結合該藥的理化性質和鼻腔給藥的特點，制備了鼻用復方伐地那非噴霧劑，藥效學研究表明該噴霧劑具有吸收迅速、起效快、副作用少等優點（研究結果另文發表）。為控制該制劑的質量，本研究建立了該制劑中鹽酸伐地那非含量的測定方法，介紹如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

L-2000高效液相色譜系統，包括L-2100（SMASH）泵、L-2200自動進樣器、L-2400紫外（可見）檢測器、N-2000色譜工作站（上海天美科學儀器有限公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；pHS-25型酸度計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

復方伐地那非噴霧劑（廣東食品藥品職業學院自制，批號：080708-1、080708-2、080708-3，規格：160 mg∶2 mL）；鹽酸伐地那非對照品（美國Sigma公司，純度：99.68%）；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.2%甲酸-2.5%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（60∶10∶30，三乙胺調節pH至3.5）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：242 nm；進樣量：10μL。理論板數按鹽酸伐地那非峰計應不得低于3 000，分離度大于1.5。

2.2 溶液的制備與干擾試驗

2.2.1 對照品溶液的制備：取干燥至恒重的鹽酸伐地那非對照品約12 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.497 6 mg·mL－1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備：精密量取本品1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再從中精密吸取2 mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備：按處方比例制備缺鹽酸伐地那非的陰性樣品噴霧劑，照“2.2.2”項下方法制得陰性樣品溶液。2.2.4 干擾試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜。記錄的供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的色譜峰（鹽酸伐地那非的保留時間約為7.5 min）；陰性樣品色譜在相應的位置上無干擾峰，說明處方中的其他物質對主藥測定結果無干擾。相關色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC Chromatograms

2.3 線性關系考察

分別精密量取上述制備好的對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別取10μL進樣測定，以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標作標準曲線，經計算回歸方程為Y＝2 820 665.59X+25 053.6（r＝0.999 9），結果表明，鹽酸伐地那非進樣量線性范圍為0.248 8～1.244μg。

2.4 精密度試驗

精密吸取濃度為0.062 2 mg·mL－1的對照品溶液在同日內連續進樣5次，測定峰面積，結果日內RSD＝0.26%。另連續測定5 d，每日進樣1次，結果日間RSD＝0.51%。

2.5 重復性試驗

取同一批號樣品（080708-3）5份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，0.45μm微孔濾膜濾過，進樣，測定峰面積，計算含量，結果平均含量為98.94%，RSD＝0.36%。

2.6 穩定性試驗

取供試品溶液（080708-3）分別在0、2、4、8、12 h內測定峰面積，結果RSD＝0.31%，表明供試品溶液在室溫放置12 h內穩定。

2.7 回收率試驗

取鹽酸伐地那非對照品與處方中其他物質，按處方比例制成相當于主藥濃度80%、100%、120%的溶液各3份，照“2.8”項下方法測定，計算平均回收率。結果，平均回收率為98.78%，RSD＝0.53%，回收率均在98.0%～102.0%之間，低、中、高濃度回收率平均分別為98.60%、99.23%、98.51%，詳見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（sn＝9）

2.8 樣品含量測定

精密量取本品1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再從中精密吸取2 mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜，按外標法以峰面積計算含量。結果，3批樣品含量均符合要求（應為標示量的90.0%～110.0%），詳見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2Results of content determination of sample（sn＝3）

3 討論

本制劑主要由鹽酸伐地那非等2種治療勃起功能障礙的藥物與適量的防腐劑、助溶劑組方而成。該制劑的主要溶劑是水，經試驗驗證，樣品經過稀釋過濾后完全能夠滿足分析要求。

經對對照品溶液的紫外光譜測定及文獻[4]對比發現，鹽酸伐地那非總體沒有明顯的特征吸收峰，最大吸收波長約為210 nm，在此末端吸收波長下，筆者發現其檢測所需的儀器穩定性及色譜條件要求較高。此外，在242 nm波長處有1個肩峰，因此，選擇242 nm為鹽酸伐地那非的檢測波長。經驗證，此檢測波長下具有較高的檢測靈敏度。

在反相高效液相色譜分析中，選擇正確的流動相pH值對堿性或者酸性化合物分析的重現性十分重要，不恰當的pH值可能導致不對稱峰、寬峰、分裂峰或肩峰。筆者考察了不同pH值條件下流動相對鹽酸伐地那非峰形及分離度的影響：當將流動相pH值調整到3.0時，鹽酸伐地那非的分離度達不到要求；將流動相pH值調整到4.0時，鹽酸伐地那非的分離度雖達到要求，但峰形拖尾；而將流動相pH值調節到3.5時，鹽酸伐地那非峰形及分離度均達到理想的要求。

本試驗建立的高效液相色譜法可準確定量分析鹽酸伐地那非原料及相關制劑中主成分的含量，方法準確、可靠、專屬性強，能滿足制劑質量標準的要求，可用于鹽酸伐地那非常規檢測及其穩定性等相關研究。

[1] 時群峰，馮 亮.持續口服鹽酸伐地那非治療勃起功能障礙的臨床分析[J].江西醫藥，2010，45（8）：786.

[2] Vitezie D.A risk-benefit assessment of sildenafil in the treatment of erectile dysfunction[J].Drug Safety，2001，24（4）：255.

[3] 陳 亮，鐘 偉，辛鐘成，等.2 062例艾力達（鹽酸伐地那非）不良反應報告分析[J].中國男科學雜志，2009，23（1）：35.

[4] Subba Rao DV，Surendranath KV，Radhakrishnanand P，et al.A stability indicating LC method for vardenafil HCl[J].Chromatographia，2008，68（9-10）：829.