酵母多糖致全身炎癥反應綜合征大鼠模型的制備

陸麒羽，周裕洋，王俊波，王 琳，孟 璐，翁家侃，余 波，全 勝

(浙江大學城市學院臨床醫學系，浙江杭州310015)

全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是感染或非感染因素作用于機體而引起的一種全身性炎癥反應綜合征。SIRS是常見的危重急癥之一，并易發展成多臟器功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)甚至多臟器功能衰竭(Multiple Organ failure，MOF)，病死率高達70%左右［1］。由于引起SIRS病因十分復雜以及確切的發病機制仍未完全明了，也缺乏理想的動物模型，因而對SIRS相關的實驗往往無法得到良好的開展。

本實驗通過酵母多糖-石蠟混懸液腹腔注射制作大鼠SIRS模型，力求制作與臨床SIRS表現一致，又排除感染因素等外源性干擾因素，符合SIRS診斷標準的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 SD大鼠48只，5～7周齡，體重160～200 g，雌雄各半，由浙江大學醫學院動物實驗中心提供，恒溫22℃室內飼養，正常光照時間8:00 a.m.-20:00 p.m.，無飲食飲水限制。動物實驗操作時間為8:00 a.m.-16:00 p.m.。將SD大鼠隨機分為正常對照組和模型實驗組，模型實驗組按不同濃度分為500 mg/kg、750 mg/kg、1 000 mg/kg組，每組12 只。

1.2 主要試劑和設備 酵母多糖(zymosan A)由SIGMA公司(z4250)提供;液體石蠟購自江西德成制藥有限公司;TNF-α ELISA定量檢測試劑盒由R＆D公司提供，IL-6，IL-10 ELISA定量檢測試劑盒由博士德生物有限公司提供。

1.3 動物實驗 實驗前18 h，SD大鼠開始禁食(不禁水)，上午8時先稱重、測直腸溫度，將酵母多糖粉劑和液體石蠟混合，高頻振蕩15 min，然后在100℃水浴80 min滅菌，制成酵母多糖濃度為100 mg/ml的混懸液，用時以40℃水浴，高頻振蕩 15 min后以 500 mg/kg、750 mg/kg、1 000 mg/kg劑量分別對3組大鼠進行腹腔注射。對照組注射滅菌生理鹽水。模型制作成功的標志根據胡森提供的動物SIRS的一般標準:①直腸溫度較正常或傷前升高或降低1℃;②呼吸頻率超過正常對照組2倍或PaCO2較對照值降低25%;③白細胞總數超過對照值的2倍或減少50%;④心率較對照值增加50%;⑤主要臟器病理學改變;⑥相關細胞因子改變［9］。根據實驗條件以及數據的穩定性，本實驗選擇①③⑤⑥四項指標來觀察SIRS模型是否成功。

1.4 大鼠SIRS模型觀察指標和方法 觀察24 h和48 h時各組大鼠的死亡率、一般情況、測量其直腸溫度和白細胞計數，而后分別取各組大鼠的肝、肺組織，肉眼觀察大體病變后，置于10%福爾馬林中浸泡固定24h。然后石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.5 WBC計數 采用自動血細胞檢測儀結合顯微鏡下手工技術，檢測各實驗組及對照組大鼠尾靜脈血標本中的WBC總數。

1.6 細胞因子的檢測 取各組24 h尾靜脈血標本，按 TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA 定量檢測試劑盒提供的操作說明書，檢測標本中TNF-α、IL-6、IL-10水平。

1.7 統計方法 所有實驗數據均使用SPSS 16.0軟件分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組計量數據統計采用方差分析(F檢驗)，及組間對照t檢驗，P﹤0.05為差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的一般情況 對照組大鼠未出現明顯的外觀及體征改變，實驗組大鼠在注射酵母多糖2h后，出現悚毛、氣促、反應遲鈍、蜷縮等現象，隨注射劑量的增加體征改變越明顯，并隨著時間的延長而加重，重者出現紫紺、昏睡甚至死亡。

2.2 病死率 正常對照組與腹腔注射酵母多糖500 mg/kg組均無大鼠死亡，腹腔注射酵母多糖1 000 mg/kg組24 h死亡數增加不明顯，而48 h死亡數較前三組均有明顯增加，腹腔注射酵母多糖750 mg/kg組死亡數較前兩組增加不明顯。具體各組病死率如表1所示。

2.3 白細胞及體溫改變 與正常組相比，實驗b組、c組、d組24 h及48 h的體溫與白細胞計數均降低，差異性非常顯著(P﹤0.01)，且降低的程度隨酵母多糖懸液濃度的增加而增加。具體數值見表2。

表1 各組大鼠死亡率Table 1 The mortality of rats in each group

表2 各組大鼠溫度及白細胞計數統計(±s)Table 2 The temperatures and total WBC numbers of rats in each group(±s)

表2 各組大鼠溫度及白細胞計數統計(±s)Table 2 The temperatures and total WBC numbers of rats in each group(±s)

48 h時c組大鼠有1只大鼠死亡，11只大鼠參與檢測;24 h時d組有2只大鼠死亡，10只大鼠參與檢測;48 h后剩余大鼠數小于10只，其結果無統計學意義;24 h時b、c、d各組和48小時b、c各組的體溫及白細胞計數與正常對照組(a)比較均為有顯著性差異，P＜0.01;24、48 h時c組與b組比較，體溫及白細胞計數均有明顯下降，*P＜0.05，#P＜0.01;24 h時d組與c組比較，體溫及白細胞計數又有明顯下降，﹠P＜0.01.

組 別24 h存活 體溫 白細胞/109·L -1 48 h存活 體溫 白細胞/109·L -1(a)正常對照組 12 38.29±0.26 12.26±0.48 12 38.22±0.38 13.30±0.61(b)酵母多糖懸液(500 mg/kg) 12 37.59±0.30 8.08±0.82 12 37.23±0.29 8.71±0.38(c)酵母多糖懸液(750 mg/kg) 12 36.93±0.28* 6.01±0.50# 11 36.52±0.29# 6.34±0.53#(d)酵母多糖懸液(1 000 mg/kg) 10 36.50±0.20﹠ 5.40±0.50﹠4--

2.4 重要臟器病理形態學改變

2.4.1 肺臟 正常對照組大鼠肺組織結構完整，肺泡腔清晰，肺泡隔無水腫、細胞浸潤等改變;腹腔注射酵母多糖懸液各組大鼠均出現不同程度的肺泡腔內充血、出血;氣管上皮纖毛脫落;肺泡間隔增寬，充血、水腫，血管擴張，大量紅細胞、單核巨噬細胞及中性粒細胞浸潤，部分肺泡腔塌陷。見圖1。

2.4.2 肝臟 正常對照組大鼠肝細胞排列整齊，大小一致，細胞核圓形居中，核膜清晰無明顯改變;腹腔注射酵母多糖懸液各組大鼠均出現不同程度的肝小葉中央靜脈及周圍肝竇明顯擴張淤血;肝細胞明顯腫脹、胞漿疏松或積水變性，但未見明顯灶性壞死。見圖2。

圖1 正常對照組與酵母多糖組大鼠肺組織病理形態學改變Fig.1 The histopathological change of lung in control group and zymosan group

圖2 正常對照組與酵母多糖組大鼠肝組織病理形態學改變Fig.2 The histopathological change of liver in control group and zymosan group

2.5 各組細胞因子水平比較與正常對照組比較:實驗c組、d組中 TNF-α、IL-6、IL-10 均有顯著升高(P ＜0.01);b組 TNF-α、IL-6均有顯著升高(P＜0.01)，IL-10水平與正常對照組相比無統計學差異(P﹥0.05)。具體數值見表3。

3 討論

全身炎癥反應綜合征(SIRS)是由感染因素和(或)非感染因素引起機體全身性、系統性瀑布樣持續過度釋放炎癥因子所致，而膿毒癥是感染因素引起的SIRS。過去認為，在膿毒癥中微生物為炎癥反應的觸發物，機體的病理生理反應是由微生物引起的。但目前多項研究證實，膿毒癥是病菌引發的反應和機體自身的病理生理改變兩方面共同參與的［5］。感染并不是炎癥反應的唯一原因。此外，觸發因素不能完全影響炎癥反應強弱。在Hukkanen的實驗中，損傷的最終表現是由機體的免疫力、體質和基因決定的。免疫反應從某種程度上來說是基因的表現型，對于相同的損傷因素，某種特定實驗動物易受到嚴重損傷，而其它的能自行恢復健康。同樣的危險因素，高反應的實驗動物發展為SIRS的機率大于細胞免疫反應低的［2］。因此可以推測，損傷因素和患者本身的身體素質決定了炎癥反應的結局［3］。

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較(±s)Table 3 The cytokine levels of rats in each group(±s)

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平比較(±s)Table 3 The cytokine levels of rats in each group(±s)

24 h時d組2只大鼠死亡，10只大鼠參與檢測;b、c、d組TNF-α，IL-6，IL-10檢測值分別與正常對照組(a)比較，*P＜0.01.

組 別24 h存活 TNF-α/pg·ml-1 IL-6/pg·ml-1 IL-10/ng·ml -1 12 4.50±2.03 105.78±43.09 1.37±0.17(b)酵母多糖懸液(500 mg/kg) 12 21.71±5.86* 385.63±75.93* 1.48±0.49(c)酵母多糖懸液(750 mg/kg) 12 30.87±6.81* 525.20±92.45* 1.95±0.17*(d)酵母多糖懸液(1 000 mg/kg) 10 66.30±10.50* 593.80±187.40* 2.20±0.20(a)正常對照組*

目前，制備MODS模型的實驗研究較多，但SIRS模型的制作卻很少。由于較高的死亡率，MODS引起了人們的高度重視，人們進行了大量MODS動物模型的干預研究，然而卻在臨床試驗中卻屢遭失敗，死亡率未見下降。作為MODS的前期表現，我們認為SIRS的早期診斷、早期治療更加重要。如果能在SIRS階段進行有效的干預，可以從根本上減少MODS的發生，從而降低病死率［8］。

制備SIRS動物模型的方法很多，較常用的有盲腸結扎穿孔術(CLP)，急性重癥胰腺炎動物模型，細菌、LPS等誘導的SIRS模型［9］。這4種都引進了外源性感染因素，難以排除感染等外因干擾，不能完全反映上述所描述的SIRS本質。而酵母多糖是一種激活劑，它能激活補體系統、前列腺素、白三稀、血小板聚集因子、氧自由基、溶菌酶和巨噬細胞等［2］，將其注入大鼠體內，會造成嚴重的腹腔炎癥，但不引入外源性感染，為非感染因素引起的SIRS，與上述描述的SIRS無論是臨床表現還是病理改變都較符合。此種炎癥反應模型的可取之處在于致病因素簡單明確，便于復制，具有明顯的SIRS表現［9］。

腹膜是人體內面積最大的上皮組織，受到感染或非感染因素刺激時，易于誘發SIRS［11-12］。因此，本研究采用腹腔注射途徑以酵母多糖-石蠟懸液作為刺激物，制備SD大鼠急性腹膜炎模型以誘發SIRS。當腹腔注射500 mg/kg酵母多糖的ZPS時，大鼠SIRS現象不明顯，若注射劑量分別增加至含750 mg/kg和1 000 mg/kg時，均能有效誘導大鼠SIRS的發生，尤其是使用高劑量(1 000 mg/kg)時，可導致大鼠注射后48 h內出現高病死率，且多次試驗結果均相似。

SIRS相關細胞因子種類繁多，包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-13 等，SIRS 時主要表現為上述因子失控性合成與釋放、啟動炎癥反應級聯放大并形成網絡式交互作用［14-15］。在SIRS及 MODS發病過程中，以細胞因子TNF-α、IL-6、IL-10 最為重要［14-16］。TNF-α 是SIRS時啟動炎癥因子級聯反應的始發因子，不僅可以激活各種炎性細胞，其本身也是一種致熱原，同時還可降低血管張力、心肌收縮力及增加血管通透性［17-18］。Miyaoka 等［13］的研究顯示外科手術后第一天患者IL-6和IL-10水平上升，且IL-6濃度以及IL-6與IL-10之比在SIRS患者中較非SIRS患者為高，由此得出檢測血清TNF-α、IL-6與IL-10水平可作為一種預測SIRS的方法。

上述結果表明，酵母多糖誘導大鼠SIRS有劑量依賴性和高重復性，穩定可靠的大鼠SIRS模型可作為SIRS發病機制研究、藥物篩選等的有效工具。

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