一種基于熒光圖像的體外抗腫瘤藥物快速篩選方法

聶曉靜，趙筱萍，王 毅

(1.浙江大學藥學院，浙江 杭州310058;2.浙江中醫藥大學，浙江杭州310053)

隨著天然產物大規模分離制備技術與高通量篩選技術的迅猛發展［1］，天然產物已成為抗腫瘤藥物篩選的重要來源之一［2］。常用的抗腫瘤活性體外篩選方法主要包括 3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-di-phenyltetrazolium bromide(MTT)法和Sulforhodamine B(SRB)法等，在實際應用中已取得了較大的成效［3］。但由于受到實驗操作和檢測方法的限制，難以滿足迅速發展的新藥研發對藥物高通量篩選(HTS)的要求。因此，建立合理、高效、簡便的抗腫瘤藥物篩選新方法，對于抗腫瘤新藥研發具有重要意義。

熒光標記技術因其具有簡便、靈敏、穩定等特點［4］，在生物醫藥領域得到了廣泛應用，并已成為高通量篩選的關鍵技術之一。二乙酸熒光素(FDA)是一種常用熒光染料，能穿越細胞質膜后在胞內被酯酶水解，因為其水解產物不能自由通過質膜且能夠發出熒光，因此，可用于活細胞標記并測定細胞活力［5］。本研究發展了一種基于FDA標記活細胞的抗腫瘤活性物質快速篩選方法，并運用該方法對中藥烏藥中抗腫瘤活性組分進行了初步篩選，為從復雜中藥組分中快速發現抗腫瘤活性物質提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 細胞熒光顯微圖像獲取平臺由浙江大學藥物信息學研究所開發，包括Leica DMI 6000 B(德國萊卡公司)倒置熒光顯微鏡、高精度可控電動平臺、電荷耦合器(CCD)攝像頭(Leica DFC 310 FX)和熒光圖像拼接及識別軟件，其基本原理與文獻［6］類似。HP1100液相色譜系統，含二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱和DAD檢測器。Finnigan LCQDeca XPplus質譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)。DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。胰蛋白酶購自Sigma公司。熒光染料二乙酸熒光素(FDA)購自南京碧云天生物技術研究所。96孔細胞培養板購自Corning公司。阿霉素對照品購自中國藥品生物制品檢定所，純度97.4%。烏藥組分由浙江大學藥物信息學研究所數字化中藥組分庫提供。

1.2 細胞培養 人肝腫瘤細胞HepG2購自中國科學院上海細胞庫，置于95%O2和CO2的37℃恒溫培養箱中，在含有10%新生牛血清的DMEM培養基中培養。

1.3 FDA濃度的選擇 取處于對數生長期的HepG2細胞，按照3 000個/孔的密度接種于96孔細胞培養板中。常規培養24 h后，用含不同濃度FDA的 PBS標記細胞，每孔100 μl，FDA終濃度分別為:10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μg/ml，每個濃度設 3 個復孔，37℃，孵育15 min。棄上清，PBS洗2次，每次100 μl，立即置于顯微鏡下拍照，并統計各孔的熒光強度。

1.4 抗腫瘤藥物快速篩選系統

1.4.1 基于熒光的抗腫瘤藥物體外篩選方法

取處于對數生長期的HepG2細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，用培養液稀釋至3×104個/ml，按照3 000個/孔的密度接種于96孔板中。常規培養24 h后，試驗組每孔加入200 μl含待測組分的培養液，終濃度為50 μg/ml，每個組分設3個復孔。對照組加入等體積的含0.1%DMSO的培養液。培養24 h后，棄上清，每孔加入含 FDA 的 PBS 溶液(2.5 μg/ml)100 μl，37℃，孵育15 min。棄上清，PBS洗2次，每次100 μl，立即置于顯微鏡下拍照，并統計各孔的熒光強度。按照下面的公式計算藥物對腫瘤細胞增殖的抑制率:抑制率(%)=(1-加藥組熒光強度/對照組熒光強度)×100%。

1.4.2 方法學研究

1.4.2.1 線性范圍 取處于對數生長期的HepG2細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，按照10 000、8 000、6 000、4 000、3 000、2 000、1 000、0個/孔的細胞密度梯度接種于細胞板中，每個密度設6個復孔。常規培養24 h后，用含FDA(2.5 μg/ml)的 PBS 標記細胞，每孔 100 μl，37℃，孵育15 min。棄上清，PBS洗2次，每次100 μl，立即置于顯微鏡下拍照，并統計各孔的熒光強度。以每孔的細胞個數為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.4.2.2 精密度 按常規方法接種腫瘤細胞，3 000個/孔。常規培養24 h后，依1.4.2.1中方法連續掃描整板60孔(舍棄邊孔)，并統計各孔的熒光強度，計算各孔熒光強度間的RSD，以考察該方法的精密度。

1.4.2.3 陽性藥阿霉素抗腫瘤活性考察 按常規方法接種腫瘤細胞，3 000個/孔。培養24 h后，加藥組每孔加入200 μl含不同濃度阿霉素的培養液，阿霉素的終濃度分別為:4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 μmol/L，每個濃度設3個復孔。對照組加入相同體積含0.1%DMSO的培養液。培養24 h后，按1.4.1中方法測定阿霉素對腫瘤細胞增殖的抑制作用。

1.4.3 烏藥組分抗腫瘤活性篩選按常規方法接種腫瘤細胞，3 000個/孔。培養24 h后，加藥組每孔加入200 μl含烏藥組分的培養液，烏藥組分終濃度為50 μg/ml，每個組分設3個復孔。并分別以4 μmol/L的阿霉素和0.1%的DMSO為陽性對照和陰性對照。培養24 h，按1.4.1中方法測定藥物對腫瘤細胞的增值抑制率。

1.4.4 活性組分的LC/MS分析 稱取活性組分少量，用50%甲醇/水溶解至5 mg/ml，離心后，進樣分析。色譜柱:ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm)。流動相:A:0.05%甲酸/水;B:乙腈。梯度洗脫程序為:5%溶劑B保持10 min，10～15 min內線性升至40%，15～60 min內線性升至100%。流速:0.8 mL/min。檢測波長:254 nm。離子源:ESI;掃描范圍100～1 500(m/z)。

2 結果

2.1 FDA濃度對熒光強度的影響 本研究考察了7個不同熒光染料濃度下的細胞熒光顯微圖像效果(如圖1所示)。實驗結果表明，在FDA濃度大于2.5 μg/ml時，均能滿足鏡下觀察及后續圖像處理要求，考慮到染料濃度過高可能會對細胞活力產生影響，故選擇2.5 μg/ml為FDA染料濃度。

2.2 方法學研究結果 實驗結果表明(如圖2)，每孔接種細胞數在0～10 000個每孔的范圍內，熒光強度與接種細胞數線性相關，計算回歸方程得 y=4665.2x+481815，r2=0.9858。連續掃描整個96孔板中60孔，發現其熒光強度變化值較小，其RSD為9.41%，表明該方法具有良好的板內精密度。

以陽性藥阿霉素驗證本方法的可靠性，實驗結果如圖3所示。結果表明，本方法能在比MTT和SRB法更短的時間內(24 h)測定藥物對腫瘤細胞活力的影響，計算所得阿霉素抑制HepG2細胞增殖作用的IC50為1.78 μmol/L。

圖1 不同FDA濃度對熒光強度的影響Fig.1 Effect of various FDA concentrations on fluorescence intensity

圖2 細胞密度與熒光強度的線性關系曲線Fig.2 Linearity curve between cell numbers per well and fluorescence intensity

圖3 不同濃度阿霉素對HepG2細胞增殖抑制作用的量效曲線Fig.3 Dose-response curve of DOX on HepG2 cell line over a concentration range of 0-4 μmol/L

2.3 烏藥組分抗腫瘤活性 如表1所示，在篩選的 26 個烏藥組分中，B08、B09、B10、C06、C09、C10、C12、C13、C14、C15 這 10 個組分對HepG2細胞增殖的抑制率均大于50%，其中組分C13和C15在50 μg/ml的濃度下，對腫瘤細胞增殖有較強的抑制作用，其抑制率均超過了90%。

2.4 活性組分分析結果 烏藥組分C13、C15的LC/MS分析結果見表2，其中 m/z為312［M-H］-的分子離子峰，為抗腫瘤活性最強的兩個烏藥組分C13和C15中的共有峰。與文獻相比對后初步推斷該化合物為異波爾定堿。

3 討論

本研究建立了一種基于細胞熒光顯微圖像的抗腫瘤活性物質快速篩選方法，并進行了染料濃度選擇、線性范圍與精密度研究等方法學考察。該方法應用于復雜中藥組分中抗腫瘤活性成分的篩選，從26個烏藥組分中篩選到兩個組分具有較強的抗腫瘤活性，進一步的LC/MS分析結果提示其中的活性化合物可能為異喹啉類生物堿異波爾定堿(Norboldine)、新木姜子堿(Laurolitsine)，其中 Norboldine和 Laurolitsine為光學異構體。已有研究表明，Norboldine對L1210和K562細胞有細胞毒作用［7］，結合分析結果與文獻報道，初步推斷烏藥中具有抗腫瘤活性的化合物為異波爾定堿(Norboldine)。

表1 烏藥組分體外抗腫瘤活性(n=3)Table 1 Anti-tumor activity of components from Lindera aggregate in vitro(n=3)

傳統的體外細胞毒測定方法如臺盼藍染色法、MTT法和SRB法等的動態范圍均為1～2 logs［8-10］，而本研究采用的FDA熒光標記活細胞法具有4logs的動態范圍［11］。同時，本研究采用的細胞熒光圖像收集平臺具有自動化程度高、快速、靈敏等優點，因此也更適用于抗腫瘤活性物質的大規模篩選。此外，與傳統的MTT和SRB法相比，本方法能夠在更短的時間(24h)內反映出藥物對腫瘤細胞損傷的量效關系，因而更適合于抗腫瘤活性物質的快速篩選。

表2 烏藥組分C13、C15的液相-質譜分析Table 2 LC/MS analysis of components C13 and C15 from Lindera aggregate

綜上所述，本研究發展了一套基于熒光細胞圖像自動收集與分析的抗腫瘤活性物質體外篩選方法。該方法快速、穩定并具有較好的線性范圍，可用于從復雜中藥組分中快速篩選抗腫瘤活性成分，為中藥藥效物質基礎研究提供了新的研究手段。

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