MIR-122對乙型肝炎病毒抗原表達的影響

朱 蕾，陳 智，陳建忠，王 靜，胡中榮，陳離偉，劉榮華，胡敏君，朱海紅

(1.浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病診治國家重點實驗室，浙江杭州310003;2.浙江大學免疫研究所，浙江杭州310058)

在我國，乙型肝炎病毒(HBV)相關性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發病率、死亡率均排名于疾病譜前列，嚴重危害人民健康［1-3］。近來，許多研究表明宿主和某些病毒都可以編碼微小 RNA(microRNA，miRNA)，在調控病毒生命周期及病毒與宿主相互作用的過程中起到非常關鍵的作用［4-7］。

人類miR-122是一種肝臟特異性表達的微小RNA，約占肝臟總miRNA的70%。它位于人第 18 號染色體上的，定位于 18q21.31［8］。近來研究表明，miR-122不僅與丙型肝炎的復制相關［10］，而且在肝細胞肝癌組織中以及所有的肝細胞肝癌衍生的細胞系中表達下調［9-10］。為了探索miR-122和HBV致病機制的關系，我們利用體外穩定表達HBV的HepG2.2.15細胞模型，利用合成的miRNA和反義技術調控細胞miR-122水平，探索miR-122水平和HBV表達之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2.2.15細胞為本所常規傳代保 存。LipofectamineTM2000、Opti-MEM I reduced serum medium、Trizol均購自美國Invitrogen公司。G418購自美國Hyclone公司。RNase Inhibitor、 MultiScribeTMReverse Transcriptase、dNTPs、10 × Reverse Transcription Buffer、Nuclease-free water、RT primer、TaqMan 2×Universal PCR Master Mix、No AmpErase UNG均購自美國 Applied Biosystems公司。HBV DNA定量試劑盒購自杭州博康有限公司。

hsa-miR-122由上海吉凱基因化學技術有限公司合成，鎖核酸修飾的LNA-anti-miR122由美國Sigma公司合成，anti-miR-122由北京奧科生物技術有限責任公司合成，anti-GFP由北京奧科生物技術有限責任公司合成，其設計如下:

1.2 方法

1.2.1 瞬時轉染HepG2.2.15細胞并分組培養 常規培養HepG2.2.15細胞于含10%胎牛血清、G418 600 μg/ml的 DMEM 完全培養液中。轉染前1天將細胞以1×105∕孔細胞接種于12孔培養板，待細胞融合率達到80% ～90%，用優化培養基(Opti-MEM I reduced serum medium)清洗2次，按照 LipofectamineTM2000說明書進行轉染。設:hsa-miR-122組、anti-GFP組、anti-miR122組和LNA anti-miR122組，其終濃度分別為 400 nmol/L、400 nmol/L、400 nmol/L和40 nmol/L。轉染5 h后，將培養基更換為含10%胎牛血清和600 μg/ml G418的DMEM培養基，繼續培養。轉染24 h收集上清，轉染48 h后收集上清和細胞。

1.2.2 時間分辨免疫熒光法檢測HBsAg和HBeAg含量 收集轉染24 h和48 h后各組HepG2.2.15細胞培養上清，時間分辨免疫熒光法檢測HBsAg和HBeAg含量。檢測方法按照試劑盒說明書。

1.2.3 定量PCR檢測HBV-DNA含量 收集轉染24 h和48 h后各組HepG2.2.15細胞培養上清，熒光定量 PCR法檢測上清中 HBV DNA含量，檢測病毒最低限值為500 copies/ml。操作方法按照試劑盒說明書。

1.2.4 熒光定量PCR檢測各組miR-122含量

轉染后48 h收集細胞，提取細胞總RNA，操作按照美國Invitrogen公司Trizol試劑說明書。逆轉錄合成 cDNA按照 TaqMan?MicroRNA Assays中說明書進行 RNA逆轉錄。0.15 μl 100 mmol/L dNTPs，1 μl MultiScribeTMReverse Transcriptase，1.50 μl 10 × Reverse Transcription Buffer，0.19 μlRNase Inhibitor，4.16 μl Nuclease-free water，5 μl 總 RNA，3 μl RT primer，混合均勻。16℃水浴 30 min，42℃水浴30 min，85℃水浴5 min，終止反應，4℃冷卻，-20℃凍存備用。參照 TaqMan?MicroRNA Assays說明書，PCR反應體系:TaqMan?2×Universal PCR Master Mix(No AmpErase?UNG)10.00 μl，TaqMan?MicroRNA Assays 20 ×TaqMan?Assay 1.00 μl，RT Product 1.33 μl，Nuclease Free Water 7.67 μl，一共 20 μl。使用Applied Biosystems 7500 Real-time PCR 儀，95℃預變性 10 min，95℃變性 15 s，60℃退火/延伸60 s，共40個循環。

1.2.5 統計學處理 所有數據均采用SPSS 15.0統計軟件包統計，計量資料各組數據均采用“均數士標準差”(±s)來表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，有顯著差異時作兩兩比較的q檢驗，最后再作顯著性P檢驗。

2 結果

2.1 轉染后HepG2.2.15細胞miR-122相對表達 轉染48 h后，實時熒光定量PCR檢測各組HepG2.2.15細胞miR-122相對表達:anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組miR-122表達明顯受抑制，顯著低于陰性對照組(P＜0.001)。hsa-miR-122組miR-122表達較陰性對照組升高，有顯著性差異(P＜0.001)。見圖1。

圖1 轉染48 h后HepG2.2.15細胞miR-122相對表達量Fig.1 Relative expression level of miR-122 in HepG2.2.15 cells 48 h post-trans-fection

2.2 轉染后HepG2.2.15細胞上清中HBsAg與HBeAg的表達 轉染24 h及48 h后，anti-miR-122組與 LNA-antimiR-122組 HBsAg表達均無差異(P=1.000)。hsa-miR-122組HBsAg表達均顯著低于陰性對照組(P＜0.01)和anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組(P＜0.001)。anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組HBsAg表達均顯著高于陰性對照組(P＜0.001)。見圖2A。

轉染24 h及48 h后，anti-miR-122組與LNA-antimiR-122組HBeAg表達均無差異(P=1.000)。hsa-miR-122組HBeAg表達均顯著低于陰性對照組(P＜0.01)和 anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組(P＜0.001)。anti-miR-122組、LNA-antimiR-122組HBeAg表達均顯著高于陰性對照組(P＜0.001)。見圖2B。

圖2 轉染24 h及48 h后HepG2.2.15細胞上清中HBsAg與HBeAg的表達Fig.2 Expression level of HBsAg and HBeAg in the supernatant24 h and 48 h post-transfection

2.3 轉染后HepG2.2.15細胞上清中HBV DNA的表達 轉染24 h與48 h后各組HBV DNA表達與陰性對照組比較無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

miR-122是肝臟特異性表達的miRNA，約占肝臟miRNAs表達的70%。這種調節肝臟發育的“肝特異性miRNA”，在肝臟的發育和分化及維持肝臟正常功能中發揮重要的作用。而應用反義寡聚核苷酸使miR-122失活后，出現肝臟功能受損、膽固醇合成降低，提示miR-122不僅參與肝臟分化的調節，還在維持肝臟正常功能中起著重要作用［11］。

Jopling等［10］發現，人類肝臟特異性的miR-122通過靶向結合HCV mRNA 5＇非編碼區并與之相互作用誘發病毒復制，是一種正調控基因表達的方式。miR-122可以與丙肝病毒基因組相互作用調節丙型肝炎病毒的表達，當miR-122被滅活，丙型肝炎病毒復制水平明顯降低。

HepG2.2.15細胞是體外研究HBV復制較為理想的細胞模型［12］。它來源于 HepG2細胞，整合了ayw型HBV全基因組，能夠部分模擬HBV的生活周期，這一細胞系可以成功表達HBV的全部病毒標志，包括HBV DNA、HBsAg、HBeAg、HBcAg、HBVDNAp 等，而且還能產生大量的復制中間體，與自然狀態的病毒顆粒一樣具有感染性，且更接近于人體肝細胞內環境的實際情況，被研究者廣泛應用于HBV復制的研究。我們實驗選用HepG2.2.15細胞為研究對象，為miRNA與HBV自然感染的臨床應用研究提供更加客觀的依據。

本研究為了探索miR-122這個肝臟特異性豐富表達的miRNA是否也與HBV復制相關，設計體外轉染 HepG2.2.15細胞，調控細胞miR-122水平，觀察轉染不同時間內細胞分泌HBeAg和HBsAg及HBV DNA復制情況，并通過熒光定量PCR方法檢測各組miR-122的含量，進一步探索miR-122和HBV表達之間的關系。我們發現miR-122與HBsAg、HBeAg的表達呈負相關，抑制細胞內miR-122水平，HBsAg與HBeAg的表達增加，上調細胞內miR-122水平，HBsAg與HBeAg的表達降低。目前已有研究表明，miR-122在大多數原發性肝癌中以及原發性肝癌衍生的細胞系中是下調的。且研究表明，HBeAg與HBsAg均陽性的HBV患者患原發性肝癌的危險率上升［13-14］。這些有可能表明HBeAg與HBsAg，miR-122與HBV相關原發性肝癌之間存在一些調控機制。miR-122的下調促進原發性肝癌的發生發展，促進HBV高表達 HBeAg與 HBsAg。而持續的 HBeAg與HBsAg高表達，更加促進了HBV患者肝臟的炎癥反應及加速HBV相關肝癌的發生進程。

我們的研究發現，miR-122與HBV DNA復制無明顯相關性，但miR-122可以降低HBV蛋白的表達，從某種角度上說明miR-122參與調節HBV的轉錄和復制。miR-122如何通過調節靶基因，繼而調節 HBV表達 HBeAg與HBsAg的機制，還需進一步探索。

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