MIR-122對IFN-α抗HCV效應的影響

李蘇娟，陳 智，朱海紅

(浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病診治國家重點實驗室，浙江杭州310003)

丙型肝炎病毒(HCV)是導致肝臟疾病的一個重要病原體，約80%的HCV感染者會發展為慢性肝炎［1］。目前，IFN-α 聯合利巴韋林(RBV)是治療慢性丙型肝炎(CHC)的標準方案，但僅有約50%患者能獲得持續病毒學應答(SVR)［2］，這與宿主、病毒和 IFN 等因素有關［3-4］。miR-122是一種肝臟特異性的miRNA，占肝臟總miRNA表達量的70%［5］，與肝臟的發育、代謝及癌癥有關［6-7］。近年來，Jopling等［8］發現miR-122促進HCV的復制，系第一個被證明與病毒復制成正相關的宿主miRNA。本研究旨在探討miR-122是否影響IFN-α的抗HCV效應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和細胞 含有HCV全長基因組的質粒pFL-Jc1由美國Apath公司惠贈，Huh7.5.1細胞來自美國斯克利普斯研究所Scott Forrest教授，由中國科學院上海巴斯德研究所鐘勁教授提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基、FBS和Opti-MEM 購自Gibco公司，IFN-α購自PBL公司，Trizol和 LipofectamineTM2000 購自Invitrogen公司，限制性內切酶Xba、綠豆核酸酶、蛋白酶 K、DNA marker、逆轉錄試劑盒和SYBR Green Taq試劑盒均購自Takara公司，T7體外轉錄試劑盒(T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System)購自 Promega公司，RNeasy Mini Kits購自Qiagen公司。

1.1.3 引物 U6和miR-122的逆轉錄引物和上下游引物均購自廣州銳博公司。GAPDH上游和下游引物分別為GAAGGTGAAGGTC GAGTC和GAAGATGGTGATGGGATTTC;HCV 5＇UTR上游和下游引物分別為GCGTTAGTAT GAGTGTCGTG 和 TCGCAAGCACCCTATCAG，均由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HCV pFL-JC1的線性化 取質粒44 μl，加入1 μl限制性內切酶 Xba 及5 μl相應緩沖液，37℃孵育2 h，使質粒線性化，取2 μl反應液以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切消化完全。用酚氯仿法純化DNA后，分別以綠豆核酸酶和蛋白酶K處理，再用酚氯仿法抽提純化DNA，用12 μl水溶解 DNA，取1 μl跑電泳檢測酶切消化后DNA片段的大小。

1.2.2 體外轉錄 以2 μg上述線性化的DNA為模板，用promega T7 RiboMAXTMRNA體外轉錄試劑盒對模板體外轉錄，反應體系為20 μl，37℃ 孵育 2 h。RNA 產物用 RNeasy Mini Kits純化，最后用50 μl無RNA酶水洗滌，保存于-80℃。

1.2.3 細胞培養 Huh7.5.1細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM完全培養基，置于37℃、5%CO2培養箱孵育。

1.2.4 HCV細胞感染模型的建立 轉染前1天，以4×105個/孔密度接種12孔細胞培養板，細胞融合度為70% ～80%。轉染時，取1.5 μg HCV RNA轉錄體，用100 μl Opti-MEM無血清培養基稀釋，輕輕混勻，室溫放置5 min;取2 μl LipofectamineTM2000，用1 00 μl Opti-MEM 無血清培養基稀釋，輕輕混勻，室溫放置5 min。將稀釋的HCV RNA和LipofectamineTM2000一起輕輕混合，室溫靜置20 min。將200 μl復合物加入12孔板的細胞中，輕輕混勻。6 h后換液，換為完全培養基。3天后，收集上清和未處理的Huh7.5.1細胞一起孵育3h，換為普通DMEM完全培養基，培養3天后即進行后續實驗。

1.2.5 IFN-α處理和miR-122 mimics轉染本實驗中IFN-α的作用終濃度參照文獻［9］，為1 000 IU/ml，作用時間為48 h。miR-122 mimics的轉染步驟同方法1.2.4，轉染終濃度和時間分別為20 nmol/L、100 nmol/L和400 nmol/L和72 h。

1.2.6 HCV的逆轉錄和實時定量PCR 按Trizol法提取總RNA。基因組DNA去除反應包括5 ×gDNA Eraser緩沖液2 μl、gDNA Eraser 1 μl、無 RNA 酶水 3 μl和總 RNA 模板 4 μl，反應條件為42℃ 2 min。逆轉錄反應體系包括5× 反轉錄緩沖液 4 μl、反轉錄酶 1 μl、反轉錄引物混合液1 μl、無RNA 酶水4 μl和 DNA 去除反應液 10 μl，逆轉錄條件為 37℃ 15 min，85℃5 s。合成的cDNA作為實時定量PCR模板，反應體系包括2×SYBR Green Taq反應液10 μl、HCV或GAPDH的正反義引物各0.4 μl、Rox 0.4 μl，滅菌蒸餾水 4.8 μl和 cDNA 模板 4 μl。實時定量PCR反應條件為95℃ 30 s，共1個循環;95℃ 5 s，60℃ 34 s，共 40 個循環。IFN-α抑制率(%)=［(IFN-α處理前HCV RNA相對表達量-IFN-α處理后 HCV RNA相對表達量)/IFN-α處理前HCV RNA相對表達量］×100%，用來衡量IFN-α的抗病毒作用。

1.2.7 miRNA的逆轉錄和實時定量PCR 按Trizol法提取總RNA。逆轉錄反應體系包括5× 反轉錄緩沖液 2 μl、逆轉錄酶 0.5 μl、U6 或miR-122的特異性逆轉錄引物2 μl、無RNA酶水 3 μl和總 RNA 模板 2.5 μl，逆轉錄條件為42℃ 15 min，85℃ 5 s。合成的cDNA作為實時定量PCR模板，反應體系包括2×SYBR Green Taq反應液10 μl、miR-122或U6的正反義引物各 2 μl、Rox 0.4 μl，滅菌蒸餾水 1.6 μl 和cDNA模板4 μl，PCR反應條件同方法1.2.6。

1.2.8 統計學分析 用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，每個實驗重復3次，數據以±s表示。多組均數間比較采用One-Way ANOVA，兩組均數之間比較采用 student-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFN-α對HCV RNA復制的影響 經IFN-α 處理 0.5 h、2 h、8 h、24 h、48 h 后，Huh7.5.1細胞內的HCV RNA分別降至原來的94%、98%、79%、54%、17%(見圖1)，與 IFN-α 作用呈時間依賴性，在48 h時降至最低，作為后續實驗的作用時間。

圖1 感染HCV的Huh7.5.1細胞經1 000 IU/ml IFN-α處理不同時間后的HCV RNA相對表達量Fig.1 The relative expression levels of HCV RNA at different time points in Huh 7.5.1 cells infected with HCV after treating with 1 000 IU/ml IFN-α

2.2 miR-122對HCV復制的影響 Huh7.5.1細胞感染HCV 72 h后，轉染終濃度為20 nmol/L、100 nmol/L 和400 nmol/L 的miR-122 mimics，72 h后檢測細胞內的HCV RNA相對表達量分別為12.70±3.75、15.3±1.81和24.9±6.58，均明顯高于對照組(P＜0.05)。見圖2。

圖2 感染HCV的Huh7.5.1細胞轉染不同濃度miR-122 mimics后HCV RNA相對表達量Fig.2 The relative expression levels of HCV RNA in Huh7.5.1 cells infected with HCV after transfecting different concentrations of miR-122 mimics

2.3 miR-122對IFN-α抗HCV效應的影響1 000 IU/ml IFN-α作用于轉染miR-122 mimics 20 nmol/L、100 nmol/L、400 nmol/L 各組 48 h后，HCV RNA相對表達量分別為3.47±1.34、5.47±1.42、10.33±2.7，隨 miR-122濃度增加而增高，并且后兩組明顯高于對照組(P＜0.01)，見圖3。由于 IFN-α處理前，各組的HCV RNA水平不一樣，我們用IFN-α抑制率來衡量IFN-α在各組的抗病毒作用。20 nmol/L組、100 nmol/L組和4 00nmol/L組的IFN-α抑制率分別為73.3% ±3.5%、64.67% ±5.5%和56.33% ±5.1%，明顯低于對照組的84% ±4.5%(P＜0.05或P＜0.01)，見圖4。

圖3 轉染不同濃度miR-122 mimics的Huh7.5.1細胞給予1 000 IU/ml IFN-α處理后細胞內的HCV RNA相對表達量Fig.3 The relative expression levels of HCV RNA in Huh7.5.1 cells transfected with different concen-trations of miR-122 mimics after treating with 1 000 IU/ml IFN-α

2.4 HCV載量對IFN-α抗病毒作用的影響由于還存在一個變量，即各組的HCV RNA表達量不同，接下來的實驗來證明IFN-α抗HCV的作用是否與HCV的病毒載量有關。給Huh7.5.1 分別感染 107拷貝、106拷貝、105拷貝HCV，1 000 IU/ml IFN-α 作用 48 h 后各組的IFN-α抑制率分別為82.33% ±5%、90.33% ±7.6%和95% ±1.5%(圖5)，105拷貝組 IFN-α抑制率明顯高于107拷貝組(P＜0.05)。

3 討論

由于缺乏有效的細胞模型和小動物模型，限制了對HCV生活周期和宿主-病毒之間相互作用的研究以及抗病毒藥物和疫苗的研發。到目前為止，關于HCV的研究多僅限于HCV患者［10］和大猩猩［11］。隨后在人肝源 Huh7 細胞株建立的HCV復制子系統使得對于HCV翻譯和復制的研究成為可能［12-13］。然而，這些復制子并不能產生感染性的 HCV顆粒。Kato等［14-15］人從一名爆發性丙型肝炎患者體內分離出一株HCV全長基因克隆，以之構建的復制子能夠在Huh7細胞及其他肝源性細胞和非肝源性細胞中有效的復制。接著，這個研究小組用體外轉錄的JFH-1 RNA轉染Huh7，發現在上清分泌有感染性病毒顆粒。然而，在JFH-1 RNA轉染的Huh7細胞中，病毒復制率和感染性差，并且將感染性上清孵育na?ve Huh7細胞后，病毒不能復制傳代。Blight等［16］人用 IFN-α長期處理含HCV復制子的Huh7細胞，消除HCV復制子，獲得對HCV易感的Huh7.5細胞株。Zhong等［17］用 IFN-γ長期處理含有 I/5AGFP-6復制子的Huh7.5細胞，獲得對HCV更易感的 Huh7.5.1細胞株。將 JFH-1轉染Huh7.5.1細胞，能高效地分泌出感染性HCV顆粒，可重復感染Huh7.5.1細胞和黑猩猩。本研究中，我們利用高復制效能的JC-1株和易感性更高的Huh7.5.1細胞建立的HCV細胞感染模型，更加接近HCV的天然生活周期。由于臨床上IFN-α為治療HCV的主要藥物，我們用IFN-α處理此細胞模型，觀察其對HCV RNA復制的影響，結果顯示，在IFN-α作用0.5h和2h時，HCV RNA沒有明顯下降，之后，在8h時才開始下降，24h已降至原來的一半，48h時降至17%，以此作為后續實驗的時間點。

在本研究中，我們觀察miR-122在細胞感染模型中對HCV復制的影響，結果表明，隨著miR-122水平的增高，HCV RNA的相對表達量也明顯升高，提示在感染模型中，miR-122促進HCV的復制，并且呈濃度依賴性。

我們觀察miR-122對IFN-α抗HCV效應的影響，發現:隨著miR-122水平的增高，IFN-α抑制率逐漸下降。由于除了miR-122這個變量外，還有一個變量——HCV載量，因此，我們給Huh7.5.1細胞感染不同載量的HCV后，給予IFN-α處理，觀察HCV載量對IFN-α抑制率的影響。結果顯示，HCV載量影響IFN-α抑制率，感染 HCV載量越多，IFN-α抑制率越低。由此推測，miR-122的表達可部分中和 IFN-α的抗HCV效應。

綜上所述，本研究成功構建了HCV細胞感染模型，在此模型中miR-122促進HCV的復制。并且，進一步實驗還發現，miR-122的表達可部分中和IFN-α的抗HCV效應。

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