胃癌組織中Livin與Caspase-9的表達(dá)及臨床意義

劉滿華 田 蕾 郭連怡 李 舒 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

凋亡是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制，凋亡通路的紊亂、促進(jìn)凋亡因子的抑制、凋亡抑制因子的過(guò)表達(dá)以及凋亡基因的表達(dá)失控，都會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Livin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成員，特異高表達(dá)于多種實(shí)體腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系，能抑制許多凋亡刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡〔1〕。Caspase-9是一種促凋亡因子，屬于凋亡蛋白家族，是Caspase系統(tǒng)引起細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵成分之一。為探討兩者對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展的影響，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃癌中Livin基因的表達(dá)及其與Caspase-9的關(guān)系，旨在探討二者在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，從而為胃癌的診斷與臨床治療提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2010年1月至2010年10月胃癌手術(shù)切除標(biāo)本78例，其中男48例、女30例，年齡42～76歲，中位年齡64歲。所有患者均經(jīng)術(shù)中快速冷凍切片和常規(guī)病理診斷確診，術(shù)前均未接受化療、放療或免疫治療。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期:Ⅰ期14例，Ⅱ期28例，Ⅲ期36例，無(wú)Ⅳ期病例。組織學(xué)分級(jí)高分化3例，中分化22例，低分化33例，未分化20例。其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例。隨機(jī)選取30例胃潰瘍患者胃黏膜組織作為對(duì)照。

1.2 試劑 Livin兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶200)、Caspase-9兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶100)為武漢博士得生物工程有限公司產(chǎn)品，PV-6000免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋技術(shù)有限公司。

1.3 方法 采用免疫組織化學(xué)PV-6000兩步法。標(biāo)本離體后迅速用10%甲醛溶液固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)冷凍切片，二甲苯脫蠟至水，蒸餾水沖洗，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復(fù)2 min后自然冷卻至室溫，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗2 min×3次。滴加一抗，4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗2 min×3次，滴加生物素標(biāo)記二抗(鼠抗兔IgG多聚體)37℃溫箱內(nèi)孵育30 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 Livin可以表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核，Caspase-9表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，采用半定量積分法依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率判斷染色結(jié)果。按染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;按陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜10%1分，10% ～49%2分，50% ～74%3分，75% ～100%4分。2項(xiàng)評(píng)分乘積≥3分為陽(yáng)性，＜3分為陰性。結(jié)果判定采用雙盲法，由2名有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)師認(rèn)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組間率比較采用 χ2檢驗(yàn)，兩指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)之間的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Livin在胃癌組織及對(duì)照胃組織中的表達(dá)情況 在78例胃癌組織中有42例Livin蛋白表達(dá)陽(yáng)性，14例Caspase-9表達(dá)陽(yáng)性，而30例對(duì)照胃組織中僅有4例Livin蛋白表達(dá)，Caspase-9表達(dá)陽(yáng)性為17例。Livin主要出現(xiàn)在腫瘤組織中，間質(zhì)細(xì)胞及臨近正常組織中不表達(dá)，見圖1，Caspase-9的表達(dá)主要位于胞質(zhì)，見圖1。Livin在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率，而Caspase-9在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率，二者的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見表1。

圖1 各組Livin及Caspase-9的表達(dá)(DAB，×400)

表1 Livin與Caspase-9在胃癌及對(duì)照胃組織中的表達(dá)(n)

2.2 Livin與Caspase-9在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Livin與Caspse-9蛋白的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小均無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。Livin與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)(P＜0.05)，隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和臨床分期的的提高而增加;與腫瘤的病理分化程度負(fù)相關(guān)，隨著腫瘤病理分化程度的提高而降低。而Caspase-9與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和臨床分期的的提高而降低;與腫瘤的病理分化程度正相關(guān)，隨著腫瘤病理分化程度的提高而增加。見表2。

2.3 胃癌組織中Livin與Caspase-9表達(dá)的關(guān)系 42例Livin蛋白表達(dá)陽(yáng)性的胃癌組織中有3例Caspase-9蛋白表達(dá)陽(yáng)性，36例Livin蛋白表達(dá)陰性的胃癌中有11例Caspase-9表達(dá)陽(yáng)性，Livin與Caspase-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01，r=－0.304)。

表2 Livin與Caspase-9在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

凋亡或細(xì)胞程序性死亡是具有獨(dú)特形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征的細(xì)胞死亡的一種遺傳機(jī)制〔2〕。細(xì)胞凋亡是機(jī)體重要的生理過(guò)程，起著維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵作用。近來(lái)一些研究表明，凋亡在腫瘤的發(fā)生中也扮演著重要的角色。

IAPs是近年來(lái)備受矚目的一類蛋白家族，其抑制凋亡的多樣性高于已發(fā)現(xiàn)的其他凋亡抑制因子家族。Livin是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，N端僅包含一個(gè)桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列BIR結(jié)構(gòu)，C端含一個(gè)RING環(huán)指結(jié)構(gòu)。Livin的主要作用是抗細(xì)胞凋亡，目前的研究認(rèn)為它主要通過(guò)其BIR區(qū)與Caspase結(jié)合啟動(dòng)以阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑，從而抑制凋亡蛋白酶的活性。研究顯示Livin在很多人類惡性腫瘤中高表達(dá)，如黑色素瘤〔3〕、腎癌〔4〕、大腸癌〔5〕、非小細(xì)胞肺癌〔6〕、胃癌〔7〕等，提示該基因可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Livin在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于非胃癌組織，二者比較有顯著性差異(P＜0.01)。本文研究還發(fā)現(xiàn)，Livin蛋白在有淋巴轉(zhuǎn)移患者中陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.01)，提示Livin除抑制細(xì)胞凋亡之外還可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。另外，Livin與腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床分期呈正相關(guān)，與腫瘤的病理分化程度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，隨著腫瘤病理分化程度的降低而增高，提示Livin蛋白的持續(xù)表達(dá)可能進(jìn)一步參與胃癌的惡性演進(jìn)過(guò)程，而且極有可能成為反映胃癌惡性程度的參考指標(biāo)之一。

Caspase是一組半胱氨酸蛋白酶家族，多數(shù)Caspase正常以非活性的前體即Caspase酶原或Procaspase形式存在，在凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)其在凋亡調(diào)控中的不同作用，Caspase家族可以分為凋亡的啟動(dòng)者和凋亡的執(zhí)行者〔8〕。Caspase-9是Caspase家族中最重要的起始因子〔9〕，屬于線粒體通路凋亡的啟動(dòng)者，在這個(gè)通路中，細(xì)胞因?yàn)閼?yīng)激，細(xì)胞色素C從線粒體中釋放入細(xì)胞質(zhì)，與凋亡蛋白激活因子1(Apaf-1)以及Procaspase-9結(jié)合，形成凋亡復(fù)合體從而導(dǎo)致Caspase-9的活化，進(jìn)而激活其下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3和Caspase-7，從而啟動(dòng)細(xì)胞死亡程序。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Caspase-9在胃癌組織中低表達(dá)，而在對(duì)照胃黏膜組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Caspase-9在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)的原因可能是:機(jī)體在致癌因素的作用下進(jìn)行陰性克隆篩選，Caspase-9表達(dá)高的細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而表達(dá)較低水平的細(xì)胞則生存了下來(lái)。由此，我們可以認(rèn)為Caspase-9是一種抑癌基因，與Soengas等〔10〕的觀點(diǎn)一致，且可能在胃癌的發(fā)病過(guò)程中扮演著重要的角色。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Caspase-9在胃癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Caspase-9活性可能在腫瘤細(xì)胞中受抑制，導(dǎo)致凋亡抑制，腫瘤細(xì)胞增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，Caspase-9陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床分期呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤的病理分化程度呈正相關(guān)(P＜0.05)，隨著腫瘤病理分化程度的增高而增高，低分化胃癌中Caspase-9的表達(dá)低于高中分化胃癌，提示低表達(dá)Caspase-9可使細(xì)胞凋亡減少，因而凋亡與增生失衡，使得癌細(xì)胞生長(zhǎng)加快。因此，促進(jìn)Caspase-9蛋白的激活或抑制其降解失活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，是抑制胃癌的有效方法。Caspase-9可能成為胃癌臨床診斷、判斷療效及監(jiān)測(cè)預(yù)后的可靠指標(biāo)。

在本研究中，Livin和Caspase-9在胃癌組織中表達(dá)具有相關(guān)性，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01，r=－0.304)，表明Livin抑制細(xì)胞凋亡可能與其抑制Caspase-9有關(guān)，而且二者的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度、臨床分期及病理分化程度有關(guān)，由此推測(cè)Livin可能通過(guò)某種信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制Caspase-9的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，引起胃癌的發(fā)生、發(fā)展。Kasof等〔11〕研究證明Livin可以和下游Caspase的活性形式Caspase-3和Caspase-7直接作用，Livin的BIR結(jié)構(gòu)能夠與Caspase結(jié)合而抑制后者的功能。Livin也可以直接抑制Procaspase-9的活化過(guò)程，使無(wú)活性的Procaspase-9不能活化成有活性的Caspase-9，而且Livin也可以直接抑制活化的Caspase-9的功能從而發(fā)揮抗凋亡的作用〔12〕。

但胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因共同參與、相互綜合作用的結(jié)果，并且參與調(diào)控的基因蛋白形成網(wǎng)絡(luò)、相互影響，有哪些因素可以誘導(dǎo)Livin基因表達(dá)，其調(diào)節(jié)過(guò)程與哪些信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，Livin在抗凋亡中的作用以及調(diào)控Caspase-9基因的確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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