尿毒清顆粒對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化中氧化應激變化的影響

胡志娟 郭 嵐 史亞男 董春霞 賈曉梅 劉 冰 牛 凱

(河北省人民醫院腎內科，河北 石家莊 050051)

腎間質纖維化(RIF)是導致各種腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同通路。大量的研究均證實腎小管-間質的損害程度與慢性腎臟疾病(CKD)患者的腎功能損害程度呈正相關〔1〕。在各種病因導致的腎臟損傷過程中，氧化應激起到重要的作用〔2～4〕。轉化生長因子β1(TGF-β1)是公認的致纖維化因子。本研究采用大鼠單側輸尿管結扎(UUO)誘導的腎間質纖維化模型，觀察UUO模型氧化應激指標及TGF-β1的變化，探討氧化應激在腎間質纖維化形成過程的作用，以及藥物對腎間質纖維化大鼠腎功能的影響和作用機制，為腎間質纖維化的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 健康雄性SD大鼠24只(由河北醫科大學動物室提供)，體重150～180 g，隨機分成4組:(1)正常對照組(n=6);(2)假手術組(n=6);(3)手術組(UUO組，n=6);(4)尿毒清組(n=6)。大鼠用硫噴妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，大鼠腹部正中偏左縱切口2 cm打開腹腔，暴露左腎，鈍性分離左輸尿管，于靠近腎盂段處行左輸尿管結扎后縫合腹腔;假手術組打開大鼠腹腔后僅分離左輸尿管，不結扎。模型建立后第二天起，每日早上8:00予用藥組尿毒清顆粒(廣州康臣生產)50 mg/kg灌胃(溶于注射用水);其余組予等量注射用水灌胃。術后14 d處死大鼠，觀察結果。

1.2 生化測定 大鼠處死時以3%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，心臟取血標本約3 ml。血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的測定在Beckman全自動生化分析儀上完成。

1.3 總超氧化物歧化酶(T-SOD)和丙二醛(MDA)含量測定

黃嘌呤氧化酶法測定左腎組織T-SOD活力、硫代巴比妥酸(TBA)法測定左腎組織MDA含量。試劑盒為上海朗頓產品。

1.4 TGF-β1的 RT-PCR分析 均采用 TRIzol(Invitrogen公司)試劑一步抽提總RNA，再逆轉錄成cDNA(逆轉錄酶AMVRT購自美國Promega公司)。以適量cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶(Promega公司)催化下行PCR，引物由上海生物工程公司合成。actin:正鏈5'-GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA-3'，負鏈5'-GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG-3';擴增條件為95℃5 min，然后95℃45 s，55℃45 s，72℃45 s(35 個循環)，72℃延伸5 min;擴增目的片段長度為375 bp。TGF-β1:正鏈5'-CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C-3'，負鏈5'-CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C-3';擴增條件為 94℃2 min，然后 94℃30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s(27 個循環)，72℃延伸 5 min;擴增目的片段長度為298 bp。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 μg/ml溴乙啶)，再用UVP凝膠圖像成像系統進行分析，以待檢測指標與actin吸光度比值來表示其相對含量(目的基因相對表達量=目的基因條帶吸光度/actin基因條帶吸光度)。

1.5 腎組織病理 經4%多聚甲醛固定腎組織石蠟包埋，制成4 μm厚切片，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精水化行HE染色。

2 結果

2.1 一般情況 肉眼觀察，假手術組腎臟大小形態正常，顏色暗紅;UUO組梗阻側腎臟腫大，顏色變淺，有囊性感，內含褐色混濁尿液，腎實質變薄，尿毒清組介于二者之間。

圖1 TGF-β1 mRNA在四組大鼠腎組織的表達

2.2 各組BUN、Scr、T-SOD活力及MDA含量 與假手術組比較，UUO組BUN、Scr升高(P＜0.05)，腎組織勻漿中MDA含量增加(P＜0.05)、T-SOD活性降低(P＜0.05)，尿毒清治療后以上指標明顯好轉(P＜0.05)。見表1。

2.3 各組TGF-β1 mRNA的表達 與假手術組比較，UUO組TGF-β1 mRNA的表達明顯增加(P＜0.01)，尿毒清治療后TGF-β1mRNA的表達下調(P＜0.01)。見表1，圖1。

2.4 腎臟病理改變 光鏡下可見(HE染色)UUO組大鼠腎間質炎細胞彌漫性浸潤，局灶性加重，腎小管明顯擴張，小管內見大量細胞管型，腎小管上皮細胞腫脹，空泡變性，腎小球、小血管未見明顯病變;尿毒清組腎間質炎細胞多灶性浸潤，部分小管擴張、上皮細胞腫脹，空泡變性。見圖2。

表1 各組大鼠腎功能、T-SOD活力、MDA含量及TGF-β1 mRNA表達比較(± s，n=6)

表1 各組大鼠腎功能、T-SOD活力、MDA含量及TGF-β1 mRNA表達比較(± s，n=6)

與假手術組比:1)P＜0.05;與手術組比:2)P＜0.05

組別 BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) T-SOD(U/mg) MDA(nmol/mg) TGF-β1 mRNA正常對照組 3.88±1.59 52.10±10.52 260.62±50.89 1.82±0.41 0.198±0.035假手術組 3.92±1.61 54.25±11.21 255.48±54.17 1.85±0.32 0.201±0.004 UUO組 10.90±1.721) 88.54±12.7481) 125.04±40.791) 3.98±0.791) 0.775±0.0141)尿毒清組 6.50±1.581)2) 72.10±14.661)2) 187.27±40.791)2) 2.75±0.651)2) 0.519±0.0291)2)F值 24.76 11.40 11.70 18.13 818.36 P值0.000 0 0.000 1 0.000 1 0.000 0 0.000 0

圖2 各組大鼠腎組織HE染色結果(×100)

3 討論

目前認為，腎間質纖維化是各種炎癥和非炎癥性腎臟疾病進展的最終結局，是所有慢性進行性腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同形態學特點〔5，6〕。UUO是目前常用的腎小管間質損傷模型之一，是主要累及腎小管間質的非免疫源性進行性腎損害的實驗動物模型。持續輸尿管梗阻導致腎小管擴張和腎間質缺血，引起腎小管上皮細胞及血管內皮細胞損傷，繼而出現以單核、淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，腎小管上皮細胞數量減少和間質纖維組織增生，進而發展為小管萎縮和間質纖維化〔7〕。

目前研究認為，TGF-β1在腎間質纖維化發生發展的多個環節中起重要作用，是主要的致纖維化因子之一。主要表現在:①促進細胞外基質合成，可促進多種ECM成分如Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型膠原和多種蛋白多糖的生成，抑制降解ECM成分的酶的合成，同時促進整合素表達而增強細胞外基質相互作用。②TGF-β1通過自分泌和旁分泌方式作用于成纖維細胞和單核細胞，促進細胞外基質及細胞因子的表達分泌，從而促進纖維化進程〔8，9〕。本實驗顯示梗阻腎間質TGF-β1的表達明顯增多，表明TGF-β1的高水平表達加速間質纖維化的進程。

氧化應激是導致細胞損傷、衰老和死亡的主要原因之一，在心血管疾病、肝肺纖維化、神經退行性疾病和癲癇等重要疾病中也扮演著重要角色。腎組織需要較高的氧耗來完成水和電解質的主動轉運和重吸收，所以腎小管易受到氧化損傷。研究表明腎臟缺血再灌注損傷和順鉑細胞毒均可引起腎間質內氧化應激得增加〔10〕。目前認為，UUO模型腎臟病理損傷與腎缺血、低氧、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、轉化生長因子 β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、活性氧(ROS)產物誘發的損傷有關。脂質過氧化是指在自由基的攻擊下不飽和脂肪酸發生過氧化反應，從而生成一系列活性氧的復雜過程。脂質過氧化使膜完整性破壞，引發細胞周圍炎癥;MDA是在氧自由基作用下發生脂質過氧化反應的一種產物，其本身也能破壞細胞膜的結構與功能，對細胞具有毒性，并能刺激間質細胞膠原基因表達，MDA量的變化提示體內脂質過氧化，間接反映細胞損傷的程度。SOD能清除超氧化物陰離子，可拮抗脂質過氧化，其活力的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力。

尿毒清顆粒由大黃、黃芪、甘草、茯苓、川芎、丹參、白術、制何首烏、姜半夏等組成，具有扶正益氣、祛濁解毒、化瘀生新作用。尿毒清顆粒作為中藥復方制劑，具有多因素、多靶點、綜合表現藥效的特點。主要成分大黃具有抑制細胞因子、生長因子生成，抑制腎小球系膜細胞增生及成纖維細胞的增殖作用。

本試驗結果表明在UUO模型腎小管間質病變中氧化應激增加，尿毒清治療后氧化應激指標下調，腎間質纖維化減輕。氧化應激反應產物的增加可能在UUO模型腎小管間質病變中有重要的作用。因此，在慢性腎衰竭的預防與治療中，抑制自由基的產生，清除已產生的自由基及加強抗自由基等方法可作為抗腎間質纖維化有效的措施。

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