補腎活血方對血管性癡呆小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的影響

于文濤 張一昕 張 杰 (河北醫科大學中醫學院，河北 石家莊 05009)

血管性癡呆(VD)是因腦血管病所致的智能及認知功能障礙，為老年人常見病、多發病。補腎中藥和活血中藥為臨床治療VD最常用藥物，具有公認的療效〔1〕。為了比較不同治法對于VD的作用效果，本研究采用反復腦缺血再灌注的方法復制VD小鼠模型，觀察補腎類中藥、活血類中藥、補腎活血類中藥對模型小鼠行為學及腦組織腦源性神經營養因子(BDNF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性昆明小鼠，體重35～40 g，購自河北醫科大學實驗動物中心。動物合格證編號:906017。

1.2 實驗用藥 補腎方:由何首烏、益智仁、胡桃肉、人參組成。活血方:郁金、川芎、丹參、當歸組成。補腎活血方:由何首烏、益智仁、胡桃肉、人參、郁金、川芎、丹參、當歸組成。上藥由本院煎藥室煎制，補腎活血方濃縮成1.428 g/ml的混懸液，補腎方、活血方濃縮成0.714 g/ml的混懸液。尼莫地平片:石家莊市華龍藥業股份有限公司生產，批準文號:國藥準字H13021882。規格:20 mg/片，使用前用蒸餾水配制成濃度為1.558 mg/ml的藥液。

1.3 主要儀器 小鼠電子水迷宮，中國醫學科學院藥物研究所。BDNF和bFGF定量酶聯檢測試劑盒:上海森雄科技實業有限公司。

1.4 分組及給藥 從實驗小鼠中隨機抽取12只作為假手術組，其余隨機分為模型組、補腎活血組、補腎組、活血組、陽性對照組，每組15只，實驗結束后除去死亡，剩余只數見表1。各治療組在造模后第2天給藥治療，補腎活血組灌服補腎活血方14.28 g/kg體重，補腎組，活血組均以7.14 g/kg體重灌服相應藥物，陽性對照組灌服15.58 mg/kgod的尼莫地平藥液，假手術組、模型組均灌服等劑量的生理鹽水，均日1次，治療14 d。

1.5 模型制備 參照文獻〔2〕，除假手術組外，其余各組小鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸正中部常規消毒，切口，分離雙側頸總動脈，用4號絲線阻斷血流20 min，同時在距尾尖1 cm處剪斷尾端，放血約0.3 ml，熱凝止血。松開絲線，恢復血流再灌注10 min后，再次阻斷血流20 min，如此重復3次，第3次再灌注后用生理鹽水清洗切口，縫合皮膚，局部注射慶大霉素0.2萬U。假手術組只分離頸總動脈，穿線但不結扎，并且尾部不放血。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 行為學檢測 采用水迷宮測試。水迷宮為黑色有機玻璃板制成的水池，分為起始區、終點區和三個盲端。實驗開始之前，設置水深為22 cm，水溫為(24±1)℃，并引導小鼠從起點區游至終點區，共訓練3次。訓練結束后，記錄小鼠5 min內從起點區游至終點區全程所需時間(5 min內未游到終點者，按5 min計)及進入盲端次數(錯誤次數)，作為學習成績。24 h后再檢測游完全程所需時間及進入盲端次數(錯誤次數)，作為記憶成績。

1.6.2 各組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的變化 斷頭處死小鼠，冰盤上快速取腦，棄去嗅球及小腦，取腦組織稱重，移至玻璃勻漿管中，并加入等倍體積的預冷生理鹽水，于冰盤上勻漿，充分研碎，使組織勻漿化。制備好的 50%勻漿3 500 r/min離心10 min，提取上清。后采用雙抗體夾心ABCELISA法檢測腦組織BDNF和bFGF含量。

1.7 統計學處理 數據運用SPSS13.0統計軟件處理，計量資料用±s表示，統計方法采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠水迷宮學習記憶成績的比較 與假手術組比較，模型組的游全程時間逐漸延長，錯誤次數增加，二者有統計學差異(P＜0.01)。與模型組比較，各治療組學習成績和記憶成績均有顯著提高，有統計學差異(P＜0.01)，補腎活血組的學習成績與記憶成績優于其他治療組(P＜0.05或P＜0.01)。表明各組均有提高學習記憶能力的作用，而補腎活血組最優。見表1。

表1 各組小鼠水迷宮學習記憶成績比較(±s)

表1 各組小鼠水迷宮學習記憶成績比較(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與補腎活血組比較:3)P＜0.05;下表同

組別 n 學習成績游全程時間(s) 錯誤次數(次)記憶成績游全程時間(s) 錯誤次數(次)假手術組 12 37.08±19.252) 2.66±1.432) 51.83±21.312) 3.08±1.732)模型組 9 136.44±52.47 8.22±3.45 170.55±70.54 9.11±3.29補腎活血組 11 71.45±25.692) 3.72±2.452) 79.91±32.412) 4.18±1.722)補腎組 11 100.09±23.312)3) 5.91±1.811)3) 119.73±44.861)3) 6.36±3.071)3)活血組 11 98.90±28.452)3) 5.73±1.791)3) 123.64±48.451)3) 6.45±1.361)3)陽性對照組 10 101.00±24.361)3) 6.00±1.881)3) 121.20±47.011)3) 6.50±3.211)3)

2.2 各組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的比較 與假手術組比較，模型組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量明顯升高，二者有統計學差異(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組比較，各治療組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量均明顯升高，有統計學差異(P＜0.05或P＜0.01);補腎活血組的BDNF含量高于其他治療組(P＜0.05或P＜0.01)，bFGF含量高于活血組和陽性對照組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的比較(±s，ng/g·prot)

表2 各組小鼠腦組織BDNF和bFGF含量的比較(±s，ng/g·prot)

組別 n BDNF bFGF假手術組 12 504.85±83.342) 48.73±10.921)模型組 9 815.74±82.65 64.90±18.48補腎活血組 11 1 085.56±188.692) 103.10±21.752)補腎組 11 974.81±92.072)3) 95.49±11.672)活血組 11 919.30±61.391)3) 89.35±13.312)3)陽性對照組 10 930.48±98.831)3) 86.05±14.132)3)

3 討論

神經營養因子(NTF)是由多種細胞分泌的一類對中樞和外周神經系統發揮營養作用的非常規營養物質，它可調節神經系統的代謝和功能活動，對神經系統損傷后的再生修復發揮著重要作用〔3〕。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)為NTF家族重要成員，廣泛分布于中樞神經系統內，具有保護神經元，促進神經生長，活化膠質細胞、修復血管內皮，促進新毛細血管形成等多種生物學活性〔4〕。

腦缺血發生后，BDNF不僅能夠支持多種神經元的存活、發育、分化和損傷后修復，還可以通過調節組織突觸可塑性，誘發和維持組織和皮質長時程增強效應而參與學習記憶過程，改善受損的學習記憶能力〔5〕。研究顯示，與非認知障礙腦梗死患者相比，血管性認知障礙患者血清BDNF水平明顯增高〔6〕，證明BDNF參與了腦梗死進展為認知障礙的病理生理過程。實驗研究顯示〔7，8〕，腦缺血后，VD大鼠腦組織的BDNF表達明顯增多，直至15 d后腦組織BDNF陽性細胞逐漸減少，BDNF的升高對缺血后腦神經干細胞的誘導分化具有促進作用。bFGF是一種具有促進血管內皮細胞和膠質細胞存活，以及新毛細血管形成等多種生物學活性的多肽物質。腦缺血時，腦皮質和海馬的bFGF表達會顯著增強，促使腦組織bFGF含量增加，通過擴張血管和選擇性地開放因缺血而關閉的微血管，提高腦血流量，改善局部缺血狀態，并能促進神經生長，改善缺血造成的學習及記憶下降〔9〕。研究顯示〔10〕，給予VD大鼠皮下注射外源性的bFGF，bFGF能遷移至海馬，誘導海馬產生巢蛋白(nestin)陽性細胞，刺激VD大鼠海馬神經干細胞增殖，修復受損組織，改善VD大鼠的學習記憶能力。研究表明〔11〕，bFGF尚可通過調節腦神經遞質5-HT和DA含量，從而改善VD小鼠學習記憶能力。

VD屬于中醫“健忘”、“呆病”范疇。中醫認為本病病位在腦，涉及肝腎心脾，其病機為髓海空虛，腦脈瘀阻，故治當以填補腎精治其本，祛瘀通絡治其標，補腎活血恰合病機。通過觀察補腎方、活血方、補腎活血方對VD模型小鼠行為學及腦組織BDNF和bFGF含量的影響。結果顯示，補腎活血組在促進小鼠學習記憶能力和提高BDNF含量方面均顯著優于補腎組和活血組，在調節bFGF含量方面明顯優于活血組。

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