9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶對小鼠學習記憶的影響

王 剛 張利敏 侯志飛 相會欣 牟飛飛 李 洪

(河北化工醫藥職業技術學院制藥工程系，河北 石家莊 050031)

乙酰膽堿酯酶 (AChE)抑制劑通過抑制AChE的活性，恢復乙酰膽堿 (ACh)的正常水平，提高膽堿能神經元的興奮性，從理論和臨床上均已證明是有效的治療阿爾茨海默病(AD)的藥物〔1〕，但因為目前多數的該類藥物選擇性低，在抑制AChE的同時，對存在于外周組織中的丁酰膽堿酯酶(BuChE)亦產生抑制作用，從而引起外周擬膽堿樣的不良反應〔2〕。因此，此類藥物的研發是當前新藥開發的熱點〔3〕。9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶是我校新合成的AChE抑制劑，本文旨在觀察該藥對AD模型小鼠的學習記憶的影響，并通過探討其對AChE和BuChE活性影響分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，清潔級，體重18～22 g，由河北省實驗動物中心提供，試驗期間飼養于專用飼養盒內，每盒5只，自由進食飲水。

1.2 藥物、試劑與儀器 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶由我校藥物化學教研室合成，批號:060803，純度為98.9%;東莨菪堿(上海禾豐制藥有限公司產品，批號0710019);AChE，BuChE活力檢測試劑盒和考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物研究所);UV-2000紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);小鼠Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物所研制)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和給藥方法 小鼠適應性飼養2 d后按隨機分為對照組、模型組和9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶給藥組(20、10和5 mg/kg劑量組)，每組10只，雌雄各半。于給藥前將受試物溶于蒸餾水，按0.2 ml/10 g容積進行灌胃，每天1次，連續10 d，空白對照組及模型對照組灌胃給予等體積的蒸餾水。于第7天給藥后1 h，除空白對照組外，其余各組給予氫溴酸東莨菪堿造模，在Morris水迷宮學習訓練前15 min小鼠腹腔注射1.5 mg/kg氫溴酸東莨菪堿，給藥容積為0.2 ml/10 g，每天1次，共4次。

1.3.2 Morris水迷宮試驗〔4〕每天對動物進行訓練，連續4 d，訓練時將小鼠放入水迷宮中自由游泳2 min以適應環境，每天訓練2次，間隔10 min，每次分別從2個不同入水點將小鼠面向容器壁放入水中游泳，記錄小鼠入水后爬上平臺所用的時間(潛伏期)，若小鼠在90 s內不能找到水下平臺，其潛伏期按90 s記錄。最后1 d正式試驗，記錄小鼠入水后爬上平臺的潛伏期。

1.3.3 生化指標測定 行為學測試完成后，各組小鼠摘眼球取血，并于4℃、3 500 r/min離心15 min，取上清后－20℃保存備用。處死小鼠，在冰塊上快速分離大腦組織，以9倍體積的生理鹽水將所取腦組織制成10%組織勻漿，將勻漿于4℃，3 500 r/min離心15 min后取上清，－20℃保存備用。分別按試劑盒說明書測定血清BuChE活性及腦組織中AChE的活性，以考馬斯亮藍試劑盒測定腦組織蛋白含量，AChE的活性以每毫克蛋白表示。

2 結果

2.1 各組小鼠學習記憶能力比較 Morris水迷宮試驗結果顯示，隨著訓練次數的增加，各組小鼠找到平臺的潛伏期逐漸縮短。與對照組相比，模型組小鼠找到平臺潛伏期顯著延長(P＜0．01)，受試物20、10 mg/kg組與模型組比較明顯縮短潛伏期(P ＜0．01或 P ＜0．05)，5 mg/kg組僅有縮短趨勢，但與模型組比較無統計學意義(P＞0．05)。見表1。

2.2 生化指標測定結果 與對照組相比，模型組腦組織AChE活性顯著升高(P＜0．01)，與模型組相比，受試物高、中劑量組AChE活性顯著下降(P＜0．01或P＜0．05);與對照組相比，模型組血清中BuChE活性顯著升高(P＜0．05)，受試物各劑量組BuChE活性與模型組比較無顯著差異(P＞0．05)。見表2。

表1 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶對東莨菪堿致學習記憶障礙小鼠Morris水迷宮潛伏期的影響(± s，n=10)

表1 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶對東莨菪堿致學習記憶障礙小鼠Morris水迷宮潛伏期的影響(± s，n=10)

與對照組比較:1)P ＜0．05，2)P ＜0．01;與模型組比較:3)P ＜ 0．05，4)P ＜0．01;下表同

組別 劑量(mg/kg) 第1天 第2天 第3天 第4天對照組 － 60．3 ±20．7 48．2 ±15．4 20．8 ±8．9 15．0 ±9．2模型組 － 87．4 ±19．3 75．2 ±20．01) 68．1 ±12．72) 64．2 ±19．52)受試物 20 81．2 ±15．5 60．0 ±13．1 32．2 ±15．44) 28．9 ±9．84)10 81．9 ±12．2 66．5 ±19．4 48．9 ±18．03) 39．9 ±15．44)5 86．4 ±20．5 66．9 ±19．7 60．3 ±14．8 54．0 ±16．3

表2 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶對東莨菪堿致學習記憶小鼠血清BuChE活性及腦組織AChE活性的影響(± s，n=10)

表2 9-(吡咯烷-2-酮基)乙酰氨基-1，2，3，4-四氫吖啶對東莨菪堿致學習記憶小鼠血清BuChE活性及腦組織AChE活性的影響(± s，n=10)

組別 劑量(mg/kg) BuChE(U/ml) AChE(U/mg)對照組 － 2．48 ±0．32 0．58 ±0．09模型組 － 2．89±0．271) 1．32±0．122)受試物 20 2．58 ±0．28 0．78 ±0．133)10 2．73 ±0．19 1．10 ±0．194)5 2．70 ±0．37 1．23 ±0．18

3 討論

學習記憶和思維是大腦的高級活動，記憶力下降是構成各種癡呆癥的早期和主要癥狀。中樞膽堿能系統是學習記憶的重要生理基礎，東莨菪堿作為小鼠記憶障礙的誘導劑，能破壞大腦皮層和海馬以及隔區等部位的膽堿能傳遞，降低體內抗氧化酶的活性，導致自由基水平的升高，破壞學習和記憶等高級機能，可模擬臨床膽堿能功能低下導致癡呆，被廣泛用于抗癡呆藥物的評價〔5〕。本試驗結果表明，小鼠連續腹腔注射東莨菪堿7 d，可以導致小鼠的學習記憶障礙，而給予膽堿酯酶抑制劑9－(吡咯烷－2－酮基)乙酰氨基－1，2，3，4－四氫吖啶可以提高 AD 模型小鼠的學習記憶能力，并且可以劑量依賴性提高模型小鼠腦組織中AChE的活性，該結果可以為其進一步的開發提供理論依據。

BuChE又稱血清膽堿酯酶或假性膽堿酯酶，廣泛分布于血清、造血細胞、心、肺等外周組織中，當抑制該酶可引起外周的擬膽堿樣的不良反應。本試驗結果表明，9－(吡咯烷－2－酮基)乙酰氨基－1，2，3，4－四氫吖啶在抑制腦 AChE 活性的同時，對外周丁酰膽堿酯酶無影響，這提示其對外周的膽堿能系統影響較小，從而可以減小或避免以往低選擇性膽堿酯酶抑制劑所帶來的外周膽堿樣不良反應。然而，除東莨菪堿致小鼠記憶損傷模型外，9－(吡咯烷－2－酮基)乙酰氨基－1，2，3，4－四氫吖啶的作用需進一步在其他AD動物模型上進行考察，并且其作用確切機制以及最終信號通路尚待進一步探討。

1 Swerdlow RH．Is aging part of Alzheimer＇s disease，or is Alzheimer＇s disease part of aging〔J〕?Neurobiol Aging，2007;28(10):1465－80．

2 喻東山．膽堿酯酶抑制劑治療阿爾采莫氏病〔J〕．四川精神衛生，2010;23(1):54－7．

3 Musia? A，Bajda M，Malawska B．Recent developments in cholinesterases inhibitors for Alzheimer＇s disease treatment〔J〕．Curr Med Chem，2007;14(25):2654－79．

4 黃曉舞，劉睿婷，呂秋軍．廣霍香醇對東莨菪堿致記憶障礙小鼠學習記憶功能的影響〔J〕．中草藥，2009;40(9):1431－3．

5 Zhang J，Zhu D，Sheng R，et al．BZYX，a novel acetylcholinesterase inhibitor，significantly improved chemicals－induced learning and memory impairments on rodents and protected PC12 cells from apoptosis induced by hydrogen peroxide〔J〕．Eur J Pharmacol，2009;613(1－3):1－9．