肝動脈化療栓塞術對老年原發性肝細胞癌患者CD4+CD25+調節性T細胞的影響

徐慧寧 紀 民 徐逢敏 (大連市第六人民醫院，遼寧 大連 116000)

老年肝癌病人由于體質虛弱，對肝臟切除手術的耐受性較差，肝動脈化療栓塞術(TACE)目前是原發性肝細胞癌(HCC)患者非手術治療的首選，可以顯著提高其生存率。調節性T細胞作為免疫抑制細胞(Treg)在腫瘤的發生、發展過程中發揮著極為重要的作用。本文著重探討TACE治療對HCC患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2009年5月至2011年5月我院HCC患者37例，診斷參照1999年第四屆全國肝癌學術會議制定的《原發性肝癌臨床診斷標準》HCC診斷標準:①至少有通過兩種影像學檢查證實病變具有HCC特征;②通過一種影像學檢查證實同時AFP＞400 μg/L;③有細胞學或組織學證據。影像學檢查結果由至少兩位不同放射科醫生共同確認。巴塞羅那臨床肝癌(BCLC)分級B級，腫塊無遠處轉移，肝功能為Child-Pugh A或B級。首次住院且行TACE治療，病理證實為HCC。男28例，女9例，年齡62～70歲。治療前患者均未接受任何抗腫瘤治療和免疫治療，TACE治療前2～3 d及治療后4 w，抽取患者清晨空腹外周靜脈血1 ml，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，送流式細胞室檢測。

1.2 TACE 采用常規Seldinger技術，經皮股動脈穿刺，選擇導管至腫瘤供血動脈，根據腫瘤血供情況進行栓塞，TACE治療方案為氟尿嘧啶750～1 000 mg、順鉑40～80 mg、絲裂霉素20 mg或表柔比星40～60 mg加超液化碘油5～20 ml，至碘化油沉積致密。

1.3 主要試劑和儀器 美國BD流式細胞儀，CD25-FITC，CD25-APC，CD4-PerCP5，CD4-FITC，CD127-PE foxP3-PE 以及相應的同型對照抗體均購自美國BD公司;破膜固定液及破膜緩沖液:購自美國BD Biosciences公司。

1.4 流式細胞儀檢測CD4+CD25+Tregs 采集新鮮的枸櫞酸鈉抗凝血 1 ml，使用密度梯度離心法分離 PBMC，取約1 ×105個細胞加入 5 μl CD25-FITC，CD4-PerCP5，CD127-PE，3組熒光標記抗體，振蕩器混勻，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌1次，離心后棄上清，加入少量PBS制成單細胞懸液;另取大約1×105個細胞，加入5 μl CD25-APC和CD4-FITC，振蕩器混勻，室溫避光染色30 min后，破膜固定15 min，應用破膜緩沖液進行洗滌一次，離心后棄上清，加入正常鼠血清進行阻斷，加入5 μl FoxP3-PE進行胞內染色，室溫避光染色30 min后應用PBS洗滌1次，離心后棄上清，加入PBS制成單細胞懸液。上機使用FlowJo軟件收獲細胞并進行分析。

2 結果

2.1 CD4+CD25+foxp3+T細胞和CD4+CD25+CD127low/-T細胞流式細胞檢測結果 見圖1。

圖1 CD4+CD25+Tregs的測定

2.2 外周血Tregs水平 CD4+CD25+foxp3+T細胞和CD4+CD25+CD127low/-T細胞流式細胞檢測結果占CD4+T淋巴細胞的比例在TACE治療4 w后較治療前均有所降低(〔(4.16% ±1.83%vs 2.56% ±1.05%，P＜0.01)，(6.78% ±2.82%vs 4.94% ±0.56%，P＜0.01)〕。

3 討論

本結果表明老年HCC患者外周血CD4+CD25+Tregs占CD4+T細胞的比例和經TACE治療前比較，無論是以經典的CD4+CD25+foxp3+或是以 CD4+CD25+CD127low/-為表型標志鑒定后，數值上均有顯著下降。分析原因，考慮有以下幾個方面:CD4+CD25+Tregs是具有低增殖性和免疫抑制特性的T細胞亞群〔1〕。體外研究試驗表明CD4+CD25+Treg抑制作用的發揮是通過細胞接觸實現的，其功能的發揮是劑量依賴性的〔2〕。Tregs與各種腫瘤的發生和發展密切相關〔3〕，多種腫瘤患者的Treg細胞水平增高〔4〕，腫瘤局部微環境中 Treg數量明顯增多〔5～7〕，在對原發性肝癌的研究中，對腫瘤局部微環境中Treg細胞數量的研究結果同樣是增多〔8〕，這可能間接導致了外周血調節性T細胞增多，TACE治療去除了腫瘤的實體細胞，使得腫瘤微環境中的Tregs減少了，間接導致了外周血中Treg下降。另一方面，TACE治療過程中應用的化療藥物等因素影響了對機體的免疫功能，減少了外周血調節性T細胞上調的因素，導致TACE治療后外周血中Treg下降。

本文研究外周血中的Treg，是因為Treg細胞水平可作為評價及判斷預后的指標〔5～7〕，Tregs細胞數量及功能的增高往往預后不良〔7，9〕，但現有研究主要針對腫瘤局部的Treg數量和功能，在臨床中應用面較局限，不能很好地指導臨床，以foxp3作為調節性T細胞的鑒定標志，由于需要破膜處理細胞，不但使結果不穩定，而且導致細胞破壞，不利于Tregs進一步分離與研究。本實驗分別以CD4+CD2 5+foxp3+和CD4+CD 2 5+CD127low/-作為Treg細胞的表型鑒定，分析其占CD4+T細胞百分比，結果比較可靠。Liu等〔10〕研究發現 CD127低表達與Foxp3表達有高度一致性，故檢測CD4+CD25+CD127low/-T細胞亦可較好地反映外周血中CD4+CD25+Tregs的百分比，其結果穩定，不破壞細胞本身。

綜上，HCC患者外周血Tregs水平是升高的，且用CD127低表達和Foxp3陽性表達兩種方法檢測HCC患者外周全血結果相一致，外周血中調節性T細胞的檢測較腫瘤微環境中Treg檢測更具有臨床應用的價值;應用CD127作為標志的檢測方法更加便捷，且不會破壞細胞本身;TACE治療可能影響調節性T細胞，從而影響老年肝癌患者的免疫功能，提示在原發性肝癌的治療過程中，檢測外周血中的Treg可以更好地判斷治療效果，評估預后。

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