原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)死亡受體與TRAIL抵抗的關(guān)系

南栗巖 齊 玲 肖振晶 趙慶旭 王 偉 于洪泉 (吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院藥劑科，吉林 吉林 30)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中的一員，作為腫瘤治療的新藥，在美國(guó)已進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)階段〔1〕。但由于在腫瘤治療研究中，TRAIL一直存在治療抵抗，因此，本文對(duì)原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行研究，通過(guò)觀察TRAIL的兩種受體——死亡受體(DR)4、DR5在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，探討在原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞中存在的TRAIL抵抗問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)〔2〕取新鮮人腦膠質(zhì)瘤組織(吉林大學(xué)第一醫(yī)院提供，病理診斷為Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤)。將組織剪成小塊(1 mm×1 mm)，置于離心管中，加入0.25%胰酶，37℃恒溫水浴中孵育30 min，離心后棄上清，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，苔盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞，加入10%DMEM/F12(Gibco)培養(yǎng)液，以1×106個(gè)/75 cm2密度接種細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置入37℃、5%CO2孵箱、飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液，1∶3傳代，獲得3株惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(GC417、GC321、GC125)。

1.2 免疫印跡檢測(cè)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中神經(jīng)分裂癥斷裂基因(DISC)成分的表達(dá)〔3〕將細(xì)胞培養(yǎng)3 d，待細(xì)胞生長(zhǎng)90%左右，棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌細(xì)胞，棄PBS，0.25%胰酶消化，將細(xì)胞收集于1.5 ml離心管中，3 000 r/min離心5min，棄上清。PBS充分洗滌細(xì)胞，離心棄上清，每個(gè)樣品加入50 μl的細(xì)胞裂解液，細(xì)胞充分裂解后，12 000 r/min 4℃離心15 min，上清移于另一管中，棄沉淀，Braford法檢測(cè)樣品蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)跑膠分離樣品，4℃轉(zhuǎn)膜封閉后，加入相應(yīng)一抗〔兔抗人死亡受體(DR)5多克隆抗體;兔抗人DR4多克隆抗體;兔抗人β-actin多克隆抗體;1∶1 000〕4℃孵育過(guò)夜。加入相應(yīng)的二抗，室溫、避光孵育1 h，膠片曝光拍照。

2 結(jié)果

Western印跡結(jié)果顯示，在三株原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，死亡受體DR5表達(dá)略有不同，GC321表達(dá)量明顯高于其他兩株細(xì)胞，GC125和GC417表達(dá)則明顯減少。在三株細(xì)胞中DR4的表達(dá)差別不明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)DR5、DR4情況

3 討論

TRAIL自發(fā)現(xiàn)至今，一直處于相對(duì)較熱的研究狀態(tài)。作為腫瘤壞死因子超家族中的一員，TRAIL可由體內(nèi)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞正常表達(dá)，并具有天然的腫瘤殺傷活性，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用〔1〕。國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行了很多關(guān)于TRAIL的研究，但現(xiàn)在困擾科研人員的難題之一就是其在多種腫瘤研究過(guò)程中出現(xiàn)TRAIL抵抗現(xiàn)象。腦腫瘤是病死率最高的腫瘤之一，惡性腫瘤占70%以上〔4〕。很多膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株及原代培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡存在抵抗，并且發(fā)表許多關(guān)于抵抗方面的報(bào)道〔5～7〕。到目前為止，對(duì)于TRAIL在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中產(chǎn)生抵抗的機(jī)制還不十分清楚，國(guó)內(nèi)對(duì)此研究較少，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤表達(dá)DR5、DR4情況進(jìn)行研究，初步探討其表達(dá)與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。

TRAIL受體有五種，包括:DR-DR4、DR5，誘捕受體(decoy receptor，DcR)-DcR1、DcR2 及護(hù)骨素(osteoprotegerin，OPG)。DR4、DR5均為Ⅰ型膜蛋白，含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)胞外富含半胱氨酸區(qū)域(cysteine-rich domain，CRD)，它與 TRAIL結(jié)合;另一個(gè)胞漿內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)，能夠傳遞死亡信號(hào)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。DcR1、DcR2及OPG與DR相似，但缺乏功能性細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域，均不能傳遞死亡信號(hào)。正常組織和細(xì)胞中表達(dá)DcR1、DcR2，與DR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TRAIL，所以TRAIL對(duì)正常的組織和細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用〔8，9〕。DR4和 DR5與TRAIL特異性結(jié)合后，可通過(guò)胞漿內(nèi)的 DD激發(fā)并傳遞凋亡信號(hào)。

本實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株GC321、GC417、GC125，這三株細(xì)胞對(duì)TRAIL的反應(yīng)性不同，GC321敏感，GC417不敏感，而GC125介于前兩者之間。Western印跡顯示，在三株原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，DR5表達(dá)略有不同，GC321表達(dá)量明顯高于其他兩株細(xì)胞，GC125和GC417表達(dá)則明顯減少;DR4的表達(dá)差別不明顯。這說(shuō)明可能DR5表達(dá)與原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性相關(guān)，但是否還有TRAIL傳導(dǎo)通路中其他因素影響細(xì)胞發(fā)生凋亡，還需要深入研究。

1 Bellail AC，Qi L，Mu lligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，2009;4(1):34-41.

2 齊 玲，金 宏，丁麗娟，等.腦腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011;15(2):227-8.

3 齊 玲，于洪泉，丁麗娟，等.Caspase-8在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抵抗TRAIL誘導(dǎo)凋亡中的作用〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011;37(4):612-6.

4 Sathornsumetee S，Reardon DA，Desjardins A，et al.Molecularly targeted therapy for malignant glioma〔J〕.Cancer，2007;110(1):13-24.

5 Bellail A，Tse MC，Song JH，et al.DR5-mediated DISC controls caspase-8 cleavage and initiation of apoptosis in human glioblastomas〔J〕.J Cell Mol Med，2010;14(6A):1303-17.

6 Xiao C，Yang BF，Asadi N，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand-induced death-inducing signaling complex and its modulation by c-FLIP and PED/PEA-15 in glioma cells〔J〕.J Biol Chem，2002;277(28):25020-5.

7 Song JH，Bellail A，Tse MC，et al.Human astrocytes are resistant to Fas ligand and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis〔J〕.J Neurosci，2006;26(12):3299-308.

8 Griffith TS，Anderson RD，Davidson BL，et al.Adenoviral-mediated transfer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand gene induces tumor cell apoptosis〔J〕.J Immunol，2000;165(5):2886-94.

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