灰樹花多糖誘導HeLa細胞凋亡的體外實驗

范曉艷 劉 娜 金岳雷 朱金玲 呂冬霞 (佳木斯大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 54007)

化療是宮頸癌較為傳統(tǒng)的治療方法，傳統(tǒng)的化療藥物有不同程度的毒副作用，長期應用后其毒副作用給患者帶來極大的痛苦甚至危及生命〔1～3〕。尋找毒性小、藥物不良反應少且有一定療效的藥物治療腫瘤成為腫瘤治療的途徑之一。研究表明，灰樹花多糖(Polysaccharide of grifola frondosa，PGF)具有穩(wěn)定血壓、降低血糖、改善脂肪代謝、增強免疫功能、抑制腫瘤、抗HIV病毒等生理活性〔4〕。本實驗探討PGF對HeLa細胞凋亡的影響，為抗腫瘤天然藥物的開發(fā)和利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌HeLa細胞購于武漢大學典型培養(yǎng)物冷藏中心。凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國)，倒置相差顯微鏡(日本)，酶標儀(LABSYSTEMS)，小牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液(杭州四季青)，二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)(上海普飛生物技術有限公司)，PGF粉末(浙江方格藥業(yè)有限公司)，順鉑粉劑(山東齊魯制藥廠)，半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)和傳代 配制含10%滅活小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。將宮頸癌HeLa細胞按1×105個/ml的濃度分別接種在含完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內，5%CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。2～3 d傳代一次，所有實驗均在細胞處于對數生長期進行。

1.2.2 藥物配制 供試藥物均用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配制。PGF設 3個濃度:0.01、0.05、0.10 mg/L。順鉑:1 mg/L。

1.2.3 MTT法檢測細胞抑制率 將對數生長期的HeLa細胞按1×104個/ml的密度移入96孔培養(yǎng)板，每孔加入200 μl細胞懸液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入不同濃度的 PGF溶液200 μl，其終濃度分別為0.01、0.05、0.10 mg/L;空白對照組中僅加10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。

每個濃度設立8個復孔，把培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h。經過 12、24、48 h 后分別加入 MTT(5 mg/L)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔再加入 150 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上，選擇490 nm波長，以空白孔調零，測定各孔吸光度值(OD)。實驗重復3次。

細胞抑制率=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%

1.2.4 蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察凋亡細胞形態(tài) 將用多聚賴氨酸處理的蓋玻片置于6孔板中，按1×105個/ml濃度接種細胞，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的PGF溶液，分別于12、24、48 h進行常規(guī)HE染色。在顯微成像系統(tǒng)下觀察結果。

1.2.5 免疫組化方法檢測caspase-3蛋白的表達 免疫組化用常規(guī)鏈酶親合素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)法，具體操作按說明書進行。鏡下觀察細胞膜和細胞質出現棕黃色或褐色為caspase-3表達陽性細胞。顯微鏡下每個區(qū)域選取不重復的隨機10個高倍視野(×400)，計算caspase-3陽性細胞數，求平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行處理，實驗數據以表示，參數統(tǒng)計采用t檢驗。

2 結果

2.1 PGF對HeLa細胞的體外抑制率 MTT結果顯示，PGF對Hela細胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關系。見表1。

表1 PGF對Hela細胞的抑制率(%，，n=8)

表1 PGF對Hela細胞的抑制率(%，，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

劑量(mg/L)抑制率對照組12 h OD值 抑制率24 h OD值 抑制率48 h OD值1.056±0.098 － 1.016±0.054 － 0.932±0.039 －0.01 0.973±0.056 7.86 0.889±0.0281)12.50 0.756±0.0371)18.88 0.05 0.881±0.0221)16.57 0.768±0.0322)24.41 0.654±0.0512)29.83 0.10 0.711±0.0682)32.67 0.623±0.0502)38.68 0.512±0.0482)45.06

2.2 PGF對Hela細胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察HE染色細胞，與對照組比較，PGF處理組可見典型的細胞體積縮小、變圓皺縮，細胞核深染，染色質濃縮和斷裂。

2.3 免疫組化法檢測caspase-3的表達 PGF促進Hela細胞的caspase-3高表達，其作用呈一定的濃度和時間依賴性。見表2。

表2 PGF對Hela細胞caspase-3表達的影響(%，)

表2 PGF對Hela細胞caspase-3表達的影響(%，)

9.33±1.52 10.11±1.67 10.46±1.50 0.01 mg/L 12.90±2.711) 12.58±1.451) 14.76±1.841)0.05 mg/L 24.76±1.972) 33.61±3.352) 38.65±3.132)0.10 mg/L 37.16±2.932) 38.93±3.622) 49.85±3.312)12 h 24 h 48 h對照組組別

3 討論

本實驗利用MTT法觀察 PGF作用于 HeLa細胞12、24、48 h后的抑制率，結果表明，PGF對HeLa細胞具有一定抑制作用，其抑制率呈現時間和劑量依賴性。HE染色觀察到典型的凋亡細胞。caspase-3是caspase家族中的成員，位于細胞凋亡caspase級聯反應的下游，通過下游效應因子切斷細胞間的信號傳遞，誘導形成凋亡小體，執(zhí)行凋亡功能〔5〕。本實驗運用免疫組化法檢測了PGF作用12、24、48 h后HeLa細胞的caspase-3蛋白的表達，結果顯示，PGF促進Hela細胞的caspase-3高表達，其作用呈一定的濃度和時間依賴性，表明PGF誘導腫瘤細胞凋亡與促進caspase-3高表達有關。

大量實驗證實，許多真菌多糖如香菇多糖、云芝多糖等具有抗腫瘤作用，有研究顯示PGF對S180肉瘤的生長具有抑制作用〔6〕。本研究進一步證實了PGF在體外能誘導腫瘤細胞凋亡作用，其作用機制可能與caspase-3高表達有關。

1 Leyvraz S，Ohnuma T，Lassus M，et al.Phase I study of carboplatin in patients with advanced cancer intermittent intravenous bolus，and 24-hour infusion〔J〕.J Clin Oncol，1985;3(10):1385-92.

2 Maines MD，Mayer RD.Inhibition of testicular cytochrome P-450-dependent steroid biosynthesis by cis-platinum.Reversal by human chorionic gonadotropin〔J〕.J Biol Chem，1985;260(10):6063-8.

3 Gandara DR，DeGregorio MW，Wold H，et al.High-dose cisplatin in hypertonic saline:reduced toxicity of a modified dose schedule and correlation with plasma pharmacokinetics.A Northern California Oncology Group Pilot Study in non-small-cell lung cancer〔J〕.J Clin Oncol，1986;4(12):1787-93.

4 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential〔J〕.Altern Med Rev，2001;6(1):48-60.

5 Nicholson DW，Thornberry NA.Caspases:killer proteases〔J〕.Trends Biochem Sci，1997;22(8):299-306.

6 杜景衛(wèi)，夏作理，李清初，等.灰樹花多糖抗S180肉瘤的實驗研究〔J〕.泰山醫(yī)學院學報，2005;26(2):95-8.