衰老血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡與S1P2受體表達(dá)的關(guān)系

閭宏偉 陳淑華 黃利華 向 紅 陽國平 鄧 昊 黃志軍 袁 洪

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，湖南 長沙 410013)

衰老是心血管疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因子之一，內(nèi)皮功能的改變在血管老化中發(fā)生最早。作為早期的病理生理改變，衰老所致的血管內(nèi)皮功能障礙在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。同時，內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中，細(xì)胞的增殖、凋亡和其他功能也會發(fā)生相應(yīng)的改變。探索衰老內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡和其他功能的變化，以及可能的發(fā)生機(jī)制，有助于延緩血管衰老，降低老年人心腦血管性疾病發(fā)病率和死亡率〔1～3〕。筆者前期研究已經(jīng)證實(shí)了體外培養(yǎng)的衰老內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成能力均有所下降，并與S1P2受體表達(dá)存在一定的相關(guān)性〔4～6〕。本研究旨在初步探討衰老內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡改變，以及與細(xì)胞S1P2受體表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源與采集 標(biāo)本均來自于中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠娩出的新生兒臍帶。于無菌條件下剪下臍帶放入裝有M199培養(yǎng)基的無菌容器中，快速移入實(shí)驗(yàn)室，1 h內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 M199培養(yǎng)基，胎牛血清(Hyclone);L-谷氨酰胺(Sigma公司);胰蛋白酶(Amresco公司);膠原酶Ⅰ、Ⅱ，青-鏈霉素(Gibco公司);S1P(biomol公司);BSA(Sigma公司);MTT(武漢博士德生物公司);Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 將取來的臍帶迅速移入潔凈操作臺內(nèi)，無菌條件下將其放入提前盛有預(yù)熱PBS的培養(yǎng)皿中，擠出臍帶中的血，用剪刀修齊兩斷面，分成約20 cm的一段。找出臍靜脈，用帶平針頭的注射器從一端插入臍靜脈，血管鉗固定，再用預(yù)熱的PBS沖洗3次以上，將血跡完全沖洗干凈。從沖洗的針頭中注入0.1%膠原酶Ⅱ使其充盈，另一條以同樣的方法注入0.1%膠原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液。取出針頭，用止血鉗夾住注入端，移入無菌燒杯中，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育13 min。取出，松開注入端的血管鉗，收集臍靜脈內(nèi)的消化液，然后注入含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液再次沖洗管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入M199完全培養(yǎng)液〔含20%胎牛血清、5 U/ml肝素、50 μg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)充物 (ECGS)、100 U/ml青霉素和鏈霉素〕，輕輕吹打均勻，按4×105個細(xì)胞種植在直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代一次;計(jì)算細(xì)胞的累積細(xì)胞群體倍增值 (CPDL);當(dāng)細(xì)胞的CPDL=60時，作為衰老細(xì)胞組 (S)，同時運(yùn)用β-半乳糖苷酶染色來證實(shí)細(xì)胞的衰老;另分別于細(xì)胞的CPDL為15、35時，收集內(nèi)皮細(xì)胞，作為年輕細(xì)胞組 (Y)和中年細(xì)胞組 (I)。

1.2.2 RT-PCR檢測Y、I和S內(nèi)皮細(xì)胞S1P2受體mRNA的表達(dá) 用TRIzolTM試劑提取每組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin作為內(nèi)對照，采用RT-PCR半定量檢測內(nèi)皮細(xì)胞的S1P2受體mRNA的表達(dá)。引物序列分別為:S1P2前向:CAAGTTCCACTCGGCAATGT， S1P2 反 向:CAGGAGGCTGAAGACAGAGG;β-actin前向:GAGACCTTCAACACCCCAG，β-actin反向:TCAGGTCCCGGCCAGCCA。方法如下:樣品94℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，60℃復(fù)性20 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠 (含溴乙啶0.5 mg/L)電泳檢測。平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 MTT法分析Y、I和S組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖 用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1 000～10 000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)90%融合。每孔加 MTT溶液 (5 mg/ml用 PBS配制，pH7.4)20 μl，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μlDMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以細(xì)胞分組為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分析Y、I和S組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡 收集培養(yǎng)的Y、I和S組內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/ml。每 100 μl的細(xì)胞懸液加 5 μl的 AnnexinV-FITC 和 1 μl PI工作液 (100 μl/ml)，根據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑盒說明處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測Y、I和S組內(nèi)皮細(xì)胞S1P2受體mRNA的表達(dá) 年輕內(nèi)皮細(xì)胞S1P2受體mRNA的表達(dá)顯著低于衰老內(nèi)皮細(xì)胞 (P＜0.01)。見圖1。

2.2 MTT法分析Y、I和S組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖 S組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力 (0.451±0.033)明顯低于 Y和 I組細(xì)胞(0.887±0.016，0.683±0.021，P＜0.01)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析Y、I和S組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡 S組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著高于Y和I組 (P＜0.01)。見圖2。

圖1 Y、I和S組內(nèi)皮細(xì)胞的S1P2受體mRNA表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析Y、I和S組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡

3 討論

細(xì)胞在體外培養(yǎng)一定代齡后，細(xì)胞增殖能力下降，最終生長停滯，細(xì)胞DNA合成能力下降，細(xì)胞周期阻滯于G1末期，不能進(jìn)入S期，該過程稱復(fù)制性衰老。細(xì)胞水平的復(fù)制性衰老作為研究整體衰老的體外模型，已被廣泛認(rèn)可。發(fā)生復(fù)制性衰老的不同類型細(xì)胞，有截然不同的凋亡敏感性，有的促進(jìn)凋亡，有的抑制凋亡，細(xì)胞凋亡參與了整個衰老過程，并在其中各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的作用。有些細(xì)胞衰老抑制細(xì)胞的凋亡，如Wang等〔7〕報(bào)道了去血清誘導(dǎo)鼠及人的成纖維細(xì)胞時，衰老細(xì)胞同年輕細(xì)胞相比，不易發(fā)生凋亡。Fung等〔8〕也報(bào)道衰老的嗅上皮細(xì)胞不容易發(fā)生凋亡。有些細(xì)胞衰老促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如Adams等〔9〕用視黃酸誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)隨增齡軟骨細(xì)胞容易發(fā)生凋亡。Hashimoto等〔10〕進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，體外軟骨細(xì)胞源性的凋亡小體具有堿性磷酸酶和NTP焦磷酸水解酶活性，能夠使鈣沉積，提示隨增齡軟骨細(xì)胞凋亡的增加可能與老年人易軟骨鈣化和患關(guān)節(jié)炎有關(guān)。對細(xì)胞衰老促進(jìn)凋亡的機(jī)制，尚無系統(tǒng)闡述，一般認(rèn)為衰老細(xì)胞線粒體DNA損傷、能量代謝障礙及自由基損傷導(dǎo)致其容易凋亡。

目前，衰老內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與細(xì)胞凋亡未見相關(guān)報(bào)道，本研究表明衰老內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力明顯下降和細(xì)胞凋亡明顯增加，同時初步闡明了衰老內(nèi)皮細(xì)胞的S1P2受體表達(dá)上調(diào)與內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力下降及細(xì)胞凋亡增加相關(guān)聯(lián)。這為進(jìn)一步研究S1P2受體介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制及老年人心腦血管性疾病的預(yù)防和治療提供了新的研究思路。

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