NF-κB在穩(wěn)定期低體重慢性阻塞性肺病患者中的表達(dá)

齊 詠 馬利軍 牛紅麗 程劍劍 吳紀(jì)珍 (河南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450003)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性炎癥過(guò)程，不僅影響肺，也可以引起顯著的全身反應(yīng)，包括體重下降、營(yíng)養(yǎng)不良、骨骼肌功能障礙等。研究發(fā)現(xiàn)50%的重度以及10%～20%的輕、中度COPD患者存在無(wú)法解釋的體重下降，部分極度消瘦，嚴(yán)重者甚至發(fā)生“肺惡病質(zhì)綜合征”，但其確切機(jī)制尚未闡明。本研究以穩(wěn)定期COPD患者為觀察對(duì)象，觀察不同營(yíng)養(yǎng)狀況COPD患者外周血單核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和炎癥因子表達(dá)情況，探討COPD體重下降與系統(tǒng)炎癥的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 30例COPD患者為我院2007年12月至2009年12月門診及住院患者，均符合我國(guó)2002年制定的《慢性阻塞性肺疾病(COPD)診治指南》中COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床屬于穩(wěn)定期，體重指數(shù)(BMI)＜18.5 kg/m2〔1〕。正常對(duì)照組30例，均來(lái)自門診健康體檢者。兩組患者在性別、年齡方面差異無(wú)顯著性，具有可比性。

1.2 方法 入選對(duì)象均進(jìn)行詳細(xì)的病史詢問(wèn)及體格檢查。

1.3 血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素-8(IL-8)濃度的檢測(cè)分離血清后采用ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-8的含量。試劑為美國(guó)RB公司產(chǎn)品，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 外周血NF-κB檢測(cè)

1.4.1 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞 受試者均于上午8～9時(shí)空腹取肘靜脈血6 ml，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，將細(xì)胞調(diào)至1 ×106/ml。

1.4.2 提取核蛋白 分離出淡黃色層單核細(xì)胞，移入另一離心管，加入10 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，離心3 000 r/min，5 min;吸除上清液，將洗過(guò)的細(xì)胞移至1.5 ml Ependorff管，再懸浮于1 ml PBS，在高速離心機(jī)中離心10 000 r/min×30 s;仔細(xì)吸除上清液，加入0.4 ml緩沖液A，放在冰上膨脹15 min;加入25 μl 10%壬基酸聚氧乙烯醚(NP-40)，強(qiáng)渦處理10 s，離心12 000 r/min ×30 s;吸除上清液，加緩沖液 B 200 μl，4℃ 強(qiáng)烈振蕩15 min;4℃離心10 000 r/min×5 min，上清液即為核蛋白，每份樣品分裝5個(gè)1 ml EP管中，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 NF-κB活性水平檢測(cè) NF-κB試劑盒購(gòu)于美國(guó)RB公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用 ELISA法檢測(cè) NF-κB在波長(zhǎng)595 nm處的吸光度值(OD值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制濃度曲線，再根據(jù)OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出NF-κB活性水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS14.0軟件包處理，數(shù)據(jù)采用±s表示，所用統(tǒng)計(jì)分析方法為成組t檢驗(yàn)及直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB含量在各組之間的變化 COPD組經(jīng)LPS刺激后NF-κB活性水平為(720.41±265.62)pg/ml，高于未經(jīng) LPS刺激組〔(457.14±227.95)pg/ml，P ＞0.05〕，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組經(jīng) LPS刺激后 NF-κB活性水平為(252.82±74.23)pg/ml，高于未經(jīng) LPS 刺激組〔(87.22 ± 33.41)pg/ml，P ＜0.05〕。

2.2 TNF-α、IL-8在COPD組和對(duì)照組血清中的濃度變化COPD組血清TNF-α、IL-8的濃度均較對(duì)照組顯著增高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同組血清TNF-α、IL-8濃度比較(±s，pg/ml)

表1 不同組血清TNF-α、IL-8濃度比較(±s，pg/ml)

IL-8 COPD組組別 n TNF-α 30 60.41±13.04 45.23±4.03正常組 30 23.20±5.83 18.82±5.14 P值 ＜0.000 15 ＜0.000 15

2.3 COPD組NF-κB的表達(dá)與血清 TNF-α、IL-8濃度的相關(guān)性 COPD組NF-κB與IL-8之間存在明顯正相關(guān)(r=0.763，P ＜0.001)，與 TNF-α 也存在正相關(guān)(r=0.407，P ＜0.05)。

2.4 COPD組炎性介質(zhì)與BMI的相關(guān)關(guān)系 TNF-α與BMI呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.433，P ＜0.05)。IL-8、NF-κB 與 BMI存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.074，-0.314，均P＞0.05)。

2.5 COPD組與對(duì)照組BMI比較 BMI水平在COPD組為(16.21±2.04)kg/m2，對(duì)照組為(24.59 ±3.11)kg/m2，組間比較差異顯著(P=0.000 67)。

3 討論

COPD不僅表現(xiàn)為肺部的局部炎癥，也表現(xiàn)為一種輕度的全身炎癥反應(yīng)〔2〕。目前對(duì)這種全身炎癥反應(yīng)尚無(wú)公認(rèn)的定義，但大多數(shù)文獻(xiàn)把其定義為炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中部分炎癥細(xì)胞和/或炎癥介質(zhì)等在血液循環(huán)中的增高，包括中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞增多、淋巴細(xì)胞中細(xì)胞色素氧化酶活性增高、單核細(xì)胞MMP-9增高以及IL-6、IL-8、TNF-α、CRP等增高。大多數(shù)炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)通過(guò)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用，細(xì)胞與介質(zhì)穩(wěn)態(tài)的破壞可以引起系統(tǒng)的慢性炎癥病理改變。Fabbri等〔2〕認(rèn)為應(yīng)稱其為慢性全身炎癥反應(yīng)綜合征，可能更能說(shuō)明COPD全身炎癥的危害。本實(shí)驗(yàn)顯示，低體重COPD患者穩(wěn)定期血清TNF-α、IL-8的濃度較正常對(duì)照組顯著增高。說(shuō)明低體重COPD患者在穩(wěn)定期存在全身炎癥反應(yīng)。

NF-κB是Sen等于1986年首次從小鼠B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的蛋白因子，激活NF-κB已成為肺部炎癥性疾病的一個(gè)重要特征。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COPD組經(jīng)LPS刺激的血樣NF-κB含量高于未經(jīng)LPS刺激的正常組，提示COPD患者在穩(wěn)定期存在全身炎癥反應(yīng)，體內(nèi)炎性因子含量較正常對(duì)照組高，與以往的研究結(jié)果一致〔3〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) NF-κB與TNF-α、IL-8的含量呈顯著正相關(guān)。NF-κB介導(dǎo)多種炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，而TNF-α、IL-8則又成為 NF-κB的激活劑，從而形成了 NF-κB與炎癥因子間的正反饋效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB可以誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白如C3、C4、血清淀粉酶、誘導(dǎo)型NO合成酶(iNOS)、環(huán)氧合酶(COX-2)等炎性酶的產(chǎn)生，說(shuō)明NF-κB除誘導(dǎo)炎性基因的表達(dá)外，還導(dǎo)致凝血-纖溶、激肽、補(bǔ)體和花生四烯酸等四大系統(tǒng)的相互激活，產(chǎn)生過(guò)度炎癥反應(yīng)。它們互相促進(jìn)，加速局部炎癥的發(fā)生發(fā)展，使肺臟反復(fù)損傷與修復(fù)、引起肺臟纖維化的發(fā)生，最終導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)的重塑和氣流阻塞，嚴(yán)重影響肺臟功能。

營(yíng)養(yǎng)不良已被認(rèn)為是COPD患者預(yù)后不良的獨(dú)立、可逆的一個(gè)標(biāo)志。BMI是營(yíng)養(yǎng)參數(shù)中一個(gè)重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)低體重COPD患者NF-κB含量、血清炎癥因子含量與BMI進(jìn)行直線相關(guān)分析。發(fā)現(xiàn)COPD患者血清TNF-α含量與BMI呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.433)。體外實(shí)驗(yàn)證明注射重組IL-6、IL-1、TNF-α可導(dǎo)致健康動(dòng)物厭食、體重減輕和惡病質(zhì)。Avram等發(fā)現(xiàn)一種高效蛋白降解途徑即泛素-蛋白酶體途徑，這個(gè)途徑主要作用是對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，而這種降解活動(dòng)依靠NF-κB來(lái)轉(zhuǎn)換，有活性的核因子進(jìn)入細(xì)胞核并和DNA上的啟動(dòng)區(qū)域結(jié)合，調(diào)整泛素蛋白酶體，最后交互作用減少肌肉蛋白的合成。

綜上所述，穩(wěn)定期低體重COPD患者存在全身炎癥反應(yīng)，NF-κB介導(dǎo)多種炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，炎性因子表達(dá)可能與COPD患者體質(zhì)量下降有關(guān)。

1 中國(guó)肥胖問(wèn)題工作組數(shù)據(jù)匯總分析協(xié)作組.我國(guó)成人體重指數(shù)和腰圍對(duì)相關(guān)疾病危險(xiǎn)因素異常的預(yù)測(cè)價(jià)值:適宜體重指數(shù)和腰圍切點(diǎn)的研究〔J〕.中華流行病學(xué)雜志，2002;23(1):5-10.

2 Fabbri LM，Rabe KF.From COPD to chronic systemic inflammatory syndrome〔J〕.Lancet，2007，370(9589):797-9.

3 齊 詠，楊 嵐，于維霞，等.氧化抗氧化失衡對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者誘導(dǎo)痰巨噬細(xì)胞NF-κB活性的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2004;24(12):1142-4.