肝癌組織中ZHX2基因啟動子甲基化及其與臨床病理特征的關系

田曉豐 趙紅蕾 孫月芳 曹 宏 (吉林大學第二醫院普外科中心，吉林 長春 3004)

ZHX2是ZHX(zinc-fingers and homeoboxes)蛋白家族成員之一，是2003年新克隆得到的轉錄抑制因子，位于染色體8q24.13，含有2個鋅指結構和5個同源結構域，其編碼的蛋白含837個氨基酸殘基，定位于細胞核內〔1〕。近年來的研究結果顯示，ZHX2參與正常肝細胞中肝癌標志物的轉錄抑制，提示ZHX2的表達缺失可能是肝細胞癌發生的關鍵因素之一。目前研究發現原發性肝細胞癌(HCC)細胞中存在異常甲基化的DNA，其中一個甲基化DNA片段為ZHX2。提示ZHX2基因啟動子甲基化為其在HCC中呈低表達的主要原因之一，進一步表明ZHX2基因與HCC發生發展有密切關系〔2〕。啟動子的高甲基化被認為是人類癌癥的標志，同時也是導致基因失活的常見機制。然而受限于寡核苷酸雜交序列或者酶切位點等原因，許多方法比較費時費力，或提供的信息有限，不能夠應用于大量序列或樣本的檢測。本研究通過亞硫酸氫鈉變性高效液相色譜(DHPLC)技術檢測HCC中ZHX2啟動子區域甲基化情況，并分析其與HCC臨床病理特征的關系，以探討ZHX2基因在HCC的發生發展和侵襲轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 24例HCC及癌旁肝組織和6例膽管結石手術切除的正常肝組織均來自2009～2010年吉林大學第二醫院手術標本。所有研究對象均有知情同意權。標本于手術摘除后5 min內采集，生理鹽水沖洗后立即液氮保存，腫瘤標本均經病理組織學切片證實為HCC。

1.2 儀器和試劑 DHPLC儀為美國Transgenomic公司WAVE?，Transgenomic Inc.，Cambridge，MA;DHPLC 分離柱:DNASep@Cartridge DNA-99-3510;洗脫液A:0.1 moL/L TEAA，0.025%ACN;洗脫液 B:0.1 mol/L TEAA，25%CAN;Master cycler PCR儀(德國Eppendorf公司);dNTP(德國Qiagen公司)，Taq酶(匹基生物工程有限公司)。低融點瓊脂糖凝膠為Invitrogen Inc.，Carlsbad，CA產品;QIA quick膠提取試劑盒為Qiagen，Valencia，CA 產品;EA DNA Methylation-gold Kit為 Zemo Research公司試劑盒;體外甲基化的DNA(Chemicon International，Temecula，CA)作為甲基化的陽性對照，人類胎盤DNA(Sigma，St.Louis，MO)作為甲基化的陰性對照。亞硫酸氫鹽修飾前配制甲基化/未甲基化的DNA溶液。

1.3 基因啟動子區域甲基化分析

1.3.1 引物設計 預測ZHX2啟動子區CG二核苷酸富集區，并根據其序列設計引物，上游引物:5'-TTTTAAAATCGTTATTATTATTTT-3'，下游引物 5'-ATTTTCTTTATGAAAAGTTCAA-3'，擴增片段長度240 bp。

1.3.2 亞硫酸鹽處理及啟動子區域目的片段擴增 按照EA DNA Methylation-gold Kit說明書，對基因組DNA，進行亞硫酸氫鈉處理，將非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶。PCR反應體系為50 μl，包括模板 DNA 5 μl、dNTP 4 μl、10 × PCR 緩沖液5 μl、10 μmol/L的上 下 游 引 物 各 1 μl、HotStar Taq DNA 聚 合 酶0.25 μl、ddH2O 34.75 μl。反應條件為:95℃預變性 5 min;94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 20 s，35 個循環;72℃ 10 min;4℃保存。

1.3.3 DHPLC 對PCR產物直接進行DHPLC分析。DHPLC使用自動化DHPLC儀器，用Transgenomic DNASep?色譜柱進行。樣品用2%的洗脫液B線性梯度洗脫，buffer B起始濃度為40%，以0.9 ml/min的流速檢測12 min，紫外檢測器在260 nm處進行檢測。每個樣品的部分變性溫度根據實驗的不同使用WAVE Navigator軟件確定。根據樣品中靶序列的保留時間確定甲基化狀態。

1.3.4 亞硫酸氫鹽處理后測序 用2%的低融點瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳，切膠回收用QIA quick膠提取試劑盒純化。使用BigDye Terminator v3.1循環測序試劑盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)測序，按說明書步驟操作。測序產物使用 DyeEx spin columns(Qiagen，Valencia，CA)純化。DNA 沉淀使用 10 μl HiDi甲酰胺(Applied Biosystems，UK)重懸，轉移至96孔光學反應板內并用隔板封閉(所有部件來自Applied Biosystems，Foster City，CA)。序列使用 ABI PRISM 3100自動 DNA序列檢測系統(Perkin-Elmer，Foster City，CA)分析。

1.4 統計學分析 采用統計學軟件SPSS10.0對兩樣本率的比較使用χ2檢驗。

2 結果

2.1 DHPLC檢測ZHX2啟動子甲基化方法的建立 啟動子通用PCR產物，在50℃非變性條件下進行雙鏈DNA片段長度測定，發現它們的保留時間完全相同。在55℃條件下按檢測突變方式進行測定，發現甲基化PCR產物保留時間為5.6 min，而非甲基化PCR產物保留時間為5.4 min。將兩種PCR產物混合后，則能夠在5.4 min和5.6 min各檢測到一個相互獨立的色譜峰。表明所建立的方法正確，可以用于下一步HCC樣本的檢測。見圖1。

2.2 DHPLC檢測樣品ZHX2啟動子區甲基化水平 膽管結石手術切除患者的正常肝組織中均可見保留時間為5.4 min的非甲基化色譜峰(圖2)，未檢測到ZHX2基因啟動子區域甲基化。對24例不同等級的肝癌組織的檢測發現，有11例可在5.6 min處檢測到甲基化峰(圖2)，甲基化陽性率為45.8%。另外，在24例癌旁肝組織檢測到3例甲基化，甲基化陽性率為16.6%，明顯低于癌組織。

2.3 ZHX2啟動子甲基化與HCC臨床病理特征的關系

ZHX2啟動子甲基化發生情況與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化程度無顯著相關性，但與血清AFP值及是否轉移有關。見表1。

圖1 ZHX2啟動子區甲基化和非甲基化PCR產物色譜圖

圖2 部分組織標本ZHX2啟動子區甲基化DHPLC測定色譜圖

表1 ZHX2啟動子甲基化與HCC臨床病理特征的關系〔n(%)〕

3 討論

啟動子的高甲基化被認為是人類癌癥的標志，同時也是導致基因失活的常見機制。越來越多學者認為HCC是基因病，必須從探明HCC發病的分子機制入手才能從根本上控制HCC的發生和發展〔3〕。隨著分子生物學的發展，對HCC發病機制的認識有了飛躍。目前普遍認為HCC的發生和發展是一個多步驟逐漸演變的復雜過程，涉及多組基因結構和表達水平的變化，包括原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活等改變〔4〕。DNA甲基化是一種影響基因表達的機制，只引起基因表達異常，并不改變DNA本身的序列和基因產物，所以這種改變是可逆的。因此，運用甲基化抑制劑使甲基化的腫瘤抑制基因去甲基化，重新發揮抑制腫瘤的功能，就有可能成為一種新的腫瘤治療途徑〔5〕。

本研究利用DHPLC方法，針對ZHX2基因啟動子重要區域，建立了甲基化定量分析標準體系，并初步應用于HCC組織樣本的檢測中。DHPLC是一種高通量、自動化的基因突變檢測技術，該技術已在醫學、癌癥、藥物等研究領域開展應用，與SSCP和DNA直接測序等突變檢測技術相比，DHPLC具有靈敏性更高，特異性更強，廉價省時等優點。DHPLC用來檢測DNA突變和單核酸多態性，可以取代傳統分子生物學技術，不需要制備凝膠，檢測DNA片段做到了全自動、高效、快速、準確，在疾病相關基因突變檢測方面提供了有效的技術手段，是一種快速有效的基因突變篩查方法。已有研究表明，ZHX2對多種HCC相關基因有調控作用，強烈提示其在HCC發生中的作用。盡管ZHX2調控的基因都具有HCC特異性表達特點，然而其自身表達廣泛，且在多種哺乳動物中十分保守〔6〕。2006年Lv等報道，在HCC中發現了ZHX2啟動子區的高度甲基化和甲基化介導的ZHX2基因表達缺失〔7〕。另有研究顯示ZHX2表達與多發性骨髓瘤惡性程度及病人預后呈負相關〔8〕。ZHX2的這種表達特點和在腫瘤中的甲基化修飾提示ZHX2具有抑癌基因特性，然而其在HCC發生中的作用尚未見報道。本研究采用DHPLC發現在正常肝組織未檢測到ZHX2基因啟動子區域甲基化，而24例HCC癌組織中有11例(45.8%)存在甲基化，提示該甲基化是腫瘤相關性的。另外，有16.6%癌旁肝組織也能檢測到甲基化，但明顯低于癌組織，有可能是由于癌旁肝組織存在不同程度的肝硬化或慢性炎癥，而并非完全正常肝組織，但也說明該甲基化有可能在HCC發生的早期或者癌前病變時就已經出現。2006年呂自力等〔9〕使用甲基化特異的PCR方法，對6例正常肝組織和32例HCC癌組織及其癌旁肝組織中ZHX2基因啟動子甲基化的情況進行了檢測，所得甲基化的數據與本研究相似，其結論為HCC中ZHX2基因啟動子甲基化與患者血清AFP值及是否伴隨轉移有關，而與腫瘤直徑及分化程度無關，與本研究相同。同時，基于ZHX2基因啟動子甲基化發生率在有轉移組的HCC癌組織中高于無轉移組，呂自力等推測可能是ZHX2基因通過與NF-YA結合后影響MMPs及TIMPs等與HCC轉移相關基因的表達〔9～11〕，參與或調節HCC的轉移，提示ZHX2甲基化的檢測為判斷HCC預后提供參考。

1 Kawata H，Yamada K，Shou Z，et al.fingers and homeoboxes(ZHX)2，a novel member of the ZHX family，functions as a transcriptional repressor〔J〕.Biochem J，2003;373(Pt 3):747-57.

2 Yamada K，Ogata-Kawata H，Matsuura K，et al.ZHX2 and ZHX3 repress cancer markers in normal hepatocytes〔J〕.Front Biosci，2009;14(1):3724-32.

3 Wagner AO，Malin C，Nlmer P.Application of denaturing high performance liquid chromatography in microbial ecology:fermentor sludge，compost and soil community profiling〔J〕.Appl Environ Microbiol，2009;75:956-64.

4 Morford LA，Davis C，Jin L，et al.The oncofetal gene glypican 3 is regulated in the postnatal liver by zinc fingers and homeoboxes 2 and in the regenerating liver by alpha-fetoprotein regulator 2〔J〕.Hepatology，2007;46(5):1541-7.

5 陳偉露，呂自力.ZHX2的研究進展〔J〕.國際病理科學與臨床雜志，2010;30(4):342-5.

6 Wu C，Qiu R，Wang J，et al.ZHX2 interacts with ephrin-B and regulates neural progenitor maintenance in the developing cerebral cortex〔J〕.J Neurosci，2009;29(23):7404-12.

7 Lv Z，Zhang M，Bi J，et al.Promoter hypermethylation of a novel gene，ZHX2，in hepatocellular carcinoma〔J〕.Am J Clin Pathol，2006;125(5):740-6.

8 Armellini A，Sarasquete ME，Garcia-Sanz R，et al.Low expression of ZHX2，but not RCBTB2 or RAN，is associated with poor outcome in multiple myeloma〔J〕.Br J Haematol，2008;141(2):212-5.

9 呂自力.ZHX2基因啟動子甲基化在肝細胞癌中的研究〔D〕.廣州:中山大學博士論文，2006.

10 Zhong ZD，Hammani K，Bae WS，et al.NF-Y and Sp1 cooperate for the transcriptional activation and cAMP response of human tissue inhibitor of metalloproteinases-2〔J〕.J Biol Chem，2000;275(24):18602-10.

11 Cappabianca L，Farina AR，Tacconelli A，et al.Reconstitution of TIMP-2 expression in SH-SY5Y neuroblastoma cells by 5-azacytidine is mediated transcriptionally by NF-Y through an inverted CCAAT site〔J〕.Exp Cell Res，2003;286(2):209-18.