NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因不同表型肝癌患者尿 8-OHdG水平觀察

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(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院,南寧 530021)

8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)可早期反映細(xì)胞DNA氧化損傷,被認(rèn)為是一種前景較好的腫瘤監(jiān)測(cè)性指標(biāo)[1]。NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路基因多態(tài)性與腫瘤的關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)[2]。2008年 9月～2010年 9月,本研究檢測(cè)了肝癌患者尿 8-OHdG,同時(shí)選取 NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路上 TNF-α(G-308A)、NF-κB(-94ins/delATTG)、iNOS(C608T)、COX-2(T8473C)位點(diǎn)為研究對(duì)象,檢測(cè)肝癌患者 NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因的多態(tài)性,觀察了不同基因表型肝癌患者尿 8-OhdG水平變化。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 肝細(xì)胞癌患者 155例(肝癌組),男 130例,女 25例,年齡為 23～62歲。所有患者均經(jīng)過(guò)術(shù)后或體外穿刺病理學(xué)檢查確診。健康體檢者151例,男 130例,女 21例 ,年齡 25～ 64歲 。

1.2 方法

1.2.1 肝癌組 NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因多態(tài)性的檢測(cè) PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)(RFLP)法。患者空腹采血 5m l,以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝保存,離心分層后取中間層多核細(xì)胞,DNA抽提試劑盒提取基因組 DNA。各位點(diǎn)的 PCR引物和限制性內(nèi)切酶設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[3～5]。PCR反應(yīng)體系的總體積為 25μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 2 min、94℃變性 15 s、62℃退火 30 s、72℃延伸 30 s,共 35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理后行1%～3%瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)酶切后的條帶判定不同的基因多態(tài)性類(lèi)型:TNF-α(G/G:107 bp;A/G:107、87、20 bp;A/A:107、87、20 bp);NF-κB(I/I:250 bp;I/D:250、200 bp;D/D:200 bp);iNOS(C/C:113、175 bp;C/T:113、142、175 bp;T/T:113、142 bp);COX-2(T/T:147 bp;T/C:147、124、23 bp;C/C:124、23 bp)。

1.2.2 尿 8-OhdG的檢測(cè) 采集兩組晨尿約 50m l于 -80℃冷凍保存,解凍震蕩混勻后以 12 000 g/min離心 5min,取上清 100μl。以 ELISA法檢測(cè)尿8-OHdG,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每份尿樣做 2個(gè)平行樣,以尿中的肌酐水平較正 8-OHdG濃度(苦味酸法檢測(cè))。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用非參數(shù)分析和多因素分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組與對(duì)照組尿 8-OHdG水平比較 肝癌組患者尿樣品中均可檢測(cè)出 8-OHdG,為(9.29±8.04)ng/mg Cr,對(duì)照組為(7.27±5.06)ng/mg Cr,兩組相比,P＜0.05。

2.2 NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因不同表型患者尿8-OHdG水平 TNF-α、NF-κB、iNOS、COX-2基因不同表型組間 8-OHdG水平相比,P＞0.05。詳見(jiàn)表1。

表1 NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因不同表型患者尿8-OHdG水平(ng/m g C r)

3 討論

有研究顯示,HBV、HCV感染、黃曲霉毒素 B1(AFB1)暴露、慢性酒精中毒等因素與肝癌發(fā)病有密切關(guān)系,上述危險(xiǎn)因素可增加細(xì)胞內(nèi)氧自由基(ROS)生成而攻擊大分子物質(zhì),同時(shí)激活炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生下游的級(jí)連反應(yīng),NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路是其中重要的一條。這些通路被激活可促使炎癥反應(yīng)加強(qiáng),產(chǎn)生更多 ROS。過(guò)度氧化應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷可能是腫瘤發(fā)病的一個(gè)共同特征。研究[6]認(rèn)為,慢性炎癥可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。氧化應(yīng)激狀態(tài)可加重細(xì)胞大分子物質(zhì)的氧化損傷,如DNA損傷等。已存在 DNA損傷或發(fā)生基因突變的增殖細(xì)胞在富含炎癥細(xì)胞和多種生物因子的微環(huán)境中持續(xù)失控性增殖,最終導(dǎo)致癌變[6]。

DNA在 ROS作用下形成 8-OHdG,其具有致突變性,在 DNA復(fù)制過(guò)程中可以與雙鏈上C以外的堿基配對(duì)形成點(diǎn)突變,其中 GC→TA突變被證實(shí)為惡性腫瘤的重要發(fā)病機(jī)制之一[1,2]。目前 8-OHdG的檢測(cè)方法較多,尿 8-OHdG檢測(cè)不易受飲食等因素影響,采集尿樣標(biāo)本方法簡(jiǎn)單,且樣品容易保存和分析[7]。本研究結(jié)果顯示,肝癌組尿 8-OHdG水平高于對(duì)照組,與已有的不同地區(qū)健康人群檢測(cè)結(jié)果相比也明顯偏高[8],這可能與廣西地區(qū)肝癌人群中黃曲霉毒素的高暴露率和高乙肝感染率有關(guān)[9]。本研究對(duì) NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路中四個(gè)重要因子——TNF-α、NF-κB、iNOS、COX-2的基因多態(tài)性進(jìn)行分析。其中,TNF-α(G-308A)變異基因位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率(14.73%)、NF-κB(-94ins/delATTG)變異等位基因的出現(xiàn)頻率(64%)均高于國(guó)內(nèi)外學(xué)者的報(bào)告[1,2,10～12];iNOS(C608T)變異等位基因的出現(xiàn)頻率(31.27%)及 COX-2(T8473C)變異等位基因的出現(xiàn)頻率(31.09%)與相關(guān)研究[5]類(lèi)似。本研究中,NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因不同型別間患者尿 8-OHdG水平無(wú)明顯差異。但我們認(rèn)為這并不能說(shuō)明兩者之間沒(méi)有關(guān)系,因?yàn)榛蚨鄳B(tài)性導(dǎo)致的變化只是復(fù)雜代謝通路上極其微小的改變,基因多態(tài)性通常被認(rèn)為是個(gè)體基因水平上的變異,只意味著單個(gè)基因序列的改變,在基因組序列中占極少的部分。同時(shí),基因多態(tài)性也只是眾多基因水平改變中的一種。所以,單個(gè)基因多態(tài)性能否決定生物學(xué)標(biāo)志物的改變還要決定于其他相關(guān)因素,如基因多態(tài)性產(chǎn)物與細(xì)胞內(nèi)化合物的相互作用等。

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