人成肌細胞來源的神經前體細胞移植對大鼠腦梗死的治療效果及意義

(1遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州 121000;2遼寧醫學院組織胚胎學教研室)

研究證實神經干細胞是對中樞神經系統疾病進行細胞替代治療的重要細胞來源［1］，但由于其取材困難等原因，神經干細胞移植治療神經疾病受到限制。近幾年的研究發現，成肌細胞可以在一定條件下體外分化為神經前體細胞［2］。2009年3月～2010年6月，我們建立大鼠腦梗死模型，將成人成肌細胞來源的神經前體細胞移植于腦內，觀察其療效并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 取6例行開顱手術患者(20～30歲)的正常顳肌組織(0.5～1.5 g)備用。SD雄性大鼠(遼寧醫學院實驗動物中心提供)。重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)為GIBCO公司產品，FBS(Hyclone公司)，小鼠抗人Nestin、兔抗人微管相關蛋白2(MAP-2)、兔抗人半乳糖腦苷脂(Galc)、小鼠抗人核抗體(Chemicon公司)，兔抗結蛋白(Desmin)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)一抗、異硫氰酸熒光素(FITC)和羅丹明(TRITC)標記的羊抗小鼠和羊抗兔二抗(購于北京中山生物公司)。人MAP-2、Galc和GFAP基因引物由上海博亞生物技術有限公司合成。冷光源為北京泰克公司產品。濾去全部紫外線與紅外線，投射出單一白色光束，波長(560±60)nm。

1.2 人成肌細胞的培養、誘導分化及鑒定 參考Baek等的研究方法［2］，用所取的顳肌組織體外培養人成肌細胞，用有限稀釋法對獲取的細胞進行純化，選取Desmin染色陽性的單細胞克隆進行擴增培養，并用誘導液進行誘導。人成肌細胞以原培養基培養者為對照。顯微鏡下觀察細胞形態變化。誘導2周后，兩組細胞行Nestin(神經干細胞標志物)免疫細胞化學染色鑒定，細胞質呈均勻紅色熒光，細胞核藍染為陽性。取誘導和對照細胞，分別接種在涂0.1%Poly-L-Lysine的蓋玻片上，用分化培養液培養7～14 d，收取細胞，行免疫細胞化學染色檢測細胞中MAP-2、GFAP、Galc的表達。均按試劑說明書操作，以PBS代替一抗作陰性對照。細胞質呈均勻紅色熒光為陽性。

1.3 腦梗死模型建立及細胞腦內移植

1.3.1 模型建立及分組 選用雄性SD大鼠42只，體質量250～300 g。參照 Watson等［3］的方法制作腦梗死模型，根據肢體放置試驗評分［4］，將術后24 h評分＞6分的大鼠淘汰，36只建模成功者隨機分為三組，各12只:A組:肌源性神經前體細胞移植組;B組:成肌細胞移植組;C組:PBS注射組(為對照組)。

1.3.2 細胞腦內移植 細胞經臺盼藍染色鑒定活力＞90%，用 PBS制備單細胞懸液(1×105/μl)。建模后第7天，三組用水合氯醛麻醉大鼠，固定在立體定向儀上，縱行切開頭皮，在梗死灶的周圍4點鉆孔，位置為 AP 2.5，L 3.8;AP 0.1，L 1.7;AP-2，L 1.7;AP-4，L 4.5，V-1.0/-1.8。A、B 組用 10 μl注射器每點移植相應細胞2 μl，注射速度為2 min，注射后留針3 min。C組注射等量PBS。自細胞移植的前1 d始每只大鼠腹腔注射環孢素A(10 mg/kg)直到取材日。

1.4 神經功能評分 各組均于細胞移植前1 d及移植后每周參考Anna-Lena等［4］法予以動物肢體放置試驗和觸覺刺激試驗，評價神經功能。觀察至建模后第35天。

1.5 各組腦內移植細胞中人核抗原、MAP-2、GFAP、Galc的檢測 建模后第36天，全麻大鼠，經左心室插管至升主動脈，快速灌入NS 100 ml，4%多聚甲醛快速灌流(10 ml/kg)固定。取出大腦，置于4%多聚甲醛液中固定24 h，30%蔗糖脫水48 h后冰凍切片，行全腦冠狀連續切片，厚25 μm。采用免疫組化SABC法染色檢測細胞人核抗原，觀察移植細胞的遷移情況。采用免疫熒光組織化學染色檢測細胞中MAP-2、GFAP、Galc的表達情況，按試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗作陰性對照?？谷撕丝贵w免疫陽性著色位于細胞核，呈綠色熒光，均呈均勻染色;MAP-2、GFAP、Galc免疫陽性著色位于細胞質和突起，呈紅色熒光;雙染色陽性分別著色于細胞核和細胞質。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。數據分析用方差分析和q檢驗、t檢驗。α=0.05。

2 結果

2.1 細胞培養及純化結果 在原代培養的第2天可見培養皿底有少量梭形細胞，體積偏小;第10～14天可見梭形或紡錘形細胞占皿底面積的70%～80%，傳代后的細胞生長速度較快，平均每3～5 d傳代1次。克隆培養的細胞在2～3周后長滿96孔培養板中的小孔，移至24孔、6孔板及25 cm2培養瓶時生長較快，3～5 d轉移1次。細胞均呈梭形，Desmin染色陽性。證明成肌細胞培養及純化成功。

2.2 成肌細胞轉化為神經前體細胞時的形態變化及染色鑒定結果 成肌細胞誘導處理的第2天即可見到大量細胞呈圓形或橢圓形狀，突起縮短，部分細胞聚集;7 d后有細胞球形成，呈懸浮生長，之后細胞球數量逐漸增多，細胞球體積逐漸增大，梭形細胞數量越來越少。細胞球切片Nestin染色陽性，在分化條件下細胞呈MAP-2、GFAP和Galc陽性著色，著色部位為胞體和突起。MAP-2陽性細胞呈神經元的形態，圓形或橢圓形的細胞體，兩端伸出細長的突起;GFAP陽性細胞胞體形態不規則，有較粗大突起;Galc陽性細胞伸出多個細小突起。證明人成肌細胞轉化神經前體細胞成功。未誘導的細胞為梭形，未見細胞球形成，細胞中MAP-2、GFAP和Galc染色均呈陰性。

2.3 三組神經功能比較 在腦梗死后2周內，各組動物的運動功能評分無明顯差異;3～5周時，A組肢體放置試驗評分均高于B、C組，觸覺刺激試驗中的膠布移除時間均短于B、C組(P均＜0.05);B組大鼠運動功能與C組相比，P＞0.05。詳見表1。

表1 三組細胞腦內移植后不同時點神經功能比較(均值)

2.4 各組腦內移植細胞中人核抗原、MAP-2、GFAP的表達 A組腦內移植細胞中可見抗MAP-2抗體、抗人核抗體和抗GFAP抗體及抗人核抗體均為陽性的細胞，B、C組未檢測到雙染色均陽性的細胞。

3 討論

多年來，成肌細胞一直被認為只能夠再生肌纖維，然而近年研究發現，成肌細胞具有多向分化潛能，能夠分化為脂肪樣細胞、成骨細胞和神經細胞等具有多種表型的細胞［5］。

本研究結果表明，從成人骨骼肌組織分離并能培養出表達成肌細胞標志物Desmin的成肌細胞，經純化后用含有bFGF、EGF、LIF的誘導液誘導，可轉化成能表達神經干細胞標志物Nestin的細胞球，形態與神經干細胞相似，同時表達神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞特異性標志物MAP-2、GFAP和Galc。提示人成肌細胞可以在體外分化為神經前體細胞。

將該肌源性神經前體細胞行腦梗死大鼠腦內移植發現，該細胞移植后能夠存活，移植后3周，腦梗死大鼠的神經功能有所改善;移植后5周，能表達神經元和神經膠質細胞標志物MAP-2和GFAP。提示腦內移植的肌源性神經前體細胞能夠分化為神經元和星形膠質細胞，具有治療腦梗死的作用。但成肌細胞腦內移植后雖然能夠存活，但是未見其向缺血區遷移，也未檢測到向神經元和神經膠質細胞轉化，移植動物神經功能沒有改善?？梢哉J為腦梗死的內環境尚不能引起成肌細胞向神經細胞的轉化，這與文獻［6］的研究結果一致。

干細胞移植促使神經功能恢復的機制有以下兩點:①移植的干細胞發揮替代作用，擴大了神經環路;②移植的細胞釋放營養因子。研究發現［7］，神經干細胞來源的神經元能夠在體內形成功能性突觸，通過免疫組化和膜片鉗技術，在腦內移植4周后可在皮層檢測到移植細胞的神經元功能活動。本研究顯示，肌源性神經前體細胞在腦內移植后2周即可觀察到受體神經功能改善，這不能夠通過功能性神經整合來解釋。移植的細胞分泌一些分子可能激活腦內細胞自身修復。最近的實驗發現［8］，在人骨髓基質細胞腦梗死模型腦內移植后7 d，腦組織中腦源性神經營養因子和神經生長因子增加。我們認為，中樞神經系統內有一定的神經儲備，移植的肌源性神經前體細胞可能激活了這些儲備的神經元使受體神經功能恢復。

本研究采用了光化學法制備腦梗死模型［3］，與目前制作腦梗死模型常用的線栓法和開顱法相比，該方法的優點是不需開顱，避免了手術造成的腦組織損傷;梗死部位發生在光照區，梗死灶的重復性和穩定性好。由于梗死灶位置恒定，可以準確的將細胞移植到腦梗死的外周部位，更適合于腦內細胞移植。因為干細胞移植的環境對其存活率有很大的影響，假如細胞移植到部位不恒定的缺血灶內，這種細胞將很難存活。

綜上所述，肌源性神經前體細胞腦內移植可改善腦梗死大鼠的運動和感覺功能障礙。成人成肌細胞取材簡單，來源豐富，在體外能夠直接誘導為神經前體細胞，其自體移植可以解決免疫排斥問題，且能避免倫理學上的困擾，因此具有廣闊的臨床應用前景。

［1］Pluchino S，Quattrini A，Brambilla E，et al.Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis［J］.Nature，2003，422(6933):688-694.

［2］Baek YS，Kang SH，Park JS，et al.Long-term cultured skeletal muscle-derived neural precursor cells and their neurogenic potentials［J］.Neuroreport，2009，20(12):1109-1114.

［3］Watson BD，Dietrich WD，Busto R，et al.Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis［J］.Ann Neurol，1985，17(5):497-504.

［4］Ohlsson AL，Johansson BB.Environment influences functional outcome of cerebral infarction in rats［J］.Stroke，1995，26(4):644-649.

［5］Saini A，Stewart CE.Adult stem cells:the therapeutic potential of skeletal muscle［J］.Curr Stem Cell Res Ther，2006，1(2):157-171.

［6］Steffel J，Wernig M，Knauf U，et al.Migration and differentiation of myogenic precursors following transplantation into the developing rat brain［J］.Stem Cells，2003，21(2):181-189.

［7］Li M，Zhang SZ，Guo YW.Human umbilical vein-derived dopaminergic-like cell transplantation with nerve growth factor ameliorates motor dysfunction in a rat model of Parkinson's disease［J］.Neurochem Res，2010，35(10):1522-1529.

［8］Yasuhara T，Matsukawa N，Hara K，et al.Notch-induced rat and human bone marrow stromal cell grafts reduce ischemic cell loss and ameliorate behavioral deficits in chronic stroke animals［J］.Stem Cells Dev，2009，18(10):1501-1514.