腦創傷模型創傷區腦組織中miRNA-21的表達變化及意義

(天津醫科大學總醫院，天津 300052)

近年發現，miRNA 可同時封閉多個靶基因的翻譯，干預調節miRNA可改變多個靶基因的表達水平，可大大提高顱腦損傷的干預效率［1］。目前，關于miRNA在腦創傷組織中的表達報道鮮見。在我們的前期研究中，采用miRNA芯片研究腦創傷大鼠模型皮層中miRNA表達變化，得到在腦創傷后14 d內的創傷皮層miRNA動態表達譜［2］。通過生物信息學分析及數據庫文獻檢索，確定miRNA-21可能為腦創傷后修復性基因［3］。2010年1～12月，我們對腦外傷大鼠模型檢測其創傷區腦組織中miRNA-21，并分析其與大鼠神經行為學評分和凋亡神經細胞的關系，為腦創傷后神經修復治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年雄性Wistar大鼠196只，體質量250～300 g，隨機分為假手術對照組(對照組)和創傷組，各98只。創傷組以液壓打擊法［4］制作大鼠腦外傷模型;對照組僅行頭皮切開和磨除骨窗，保持硬膜完整，不進行打擊。頭皮切口均消毒縫合。兩組分籠喂養，晝夜交替光照12 h，飼養環境溫度為(22±2)℃，相對濕度為20%～50%。

1.2 觀察指標及方法

1.2.1 大鼠的神經行為學評分 分別在創傷后2、12、24、48、72 h 和 7、14 d，采用神經行為學評分標準［5］，共5項(平衡能力、生理反射檢測、提尾反射、運動評估、感覺功能)，0分為正常，1～6分為輕型損傷，7～12分為中型損傷，13～18分為重型損傷。

1.2.2 腦組織中miRNA-21檢測及凋亡細胞計數神經行為學評分后分別于上述時點處死大鼠，每次14只。處死后立即斷頭取腦組織，選取創傷灶邊緣水腫區皮層組織，顯微鏡下清除軟膜及血管，生理鹽水漂洗，裝入凍存管置液氮速凍后轉至－80℃冰箱保存待用。其中7只標本采用定量PCR法檢測miRNA-21。以U6為內參，設計、合成相應的PCR引物，先取100 ng總miRNA-21加入20 μl逆轉錄體系，16 ℃ 30 min，37 ℃ 30 min，70 ℃ 10 min，4 ℃保存。取1 μl cDNA 加入20 μl Realtime PCR 體系，擴增反應程序:95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃30 s，74℃ 3 s，測熒光強度，重復40個循環。75～95℃繪制溶解曲線，確定校準基因后再以同樣模板和擴增反應程序通過qRT-PCR擴增目標基因miRNA-21和內標基因RNA［6］。通過統計數據轉化成線性形式計算出基因表達相對量2－ΔΔCT值。

另7只標本石蠟包埋、切片，采用TUNEL法進行凋亡神經細胞染色。按試劑盒說明書操作。細胞核呈棕黃色者為凋亡細胞，在20倍目鏡和40倍物鏡下計數，每一標本計數6張切片，每張切片在創傷灶與正常皮層的交界區計數6個視野，累計計數。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。數據用±s來表示，兩組同一時點數據比較采用獨立樣本t檢驗;miRNA-21表達水平與神經行為學評分和凋亡神經細胞相關性分析采用Pearson積差相關檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腦組織中miRNA-21表達水平比較 與對照組比較，創傷組腦組織中miRNA-21表達明顯上調，于48 h達峰值，7 d后趨于基線水平;各時點miRNA-21表達量均高于對照組相同時點(P均＜0.05)。詳見表1。

表1 兩組創傷后各時點腦組織中miRNA-21相對表達量比較(±s)

表1 兩組創傷后各時點腦組織中miRNA-21相對表達量比較(±s)

組別miRNA-21 2 h 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d 14 d對照組 1 1.20 ±0.23 1.30 ±0.25 1.30 ±0.65 0.90 ±0.24 1.10 ±0.13 0.90 ±0.12創傷組 12.48 ±0.19 39.84 ±1.78 137.16 ±2.89 229.89 ±1.23 89.10 ±2.33 62.30 ±1.90 60.80 ±3.67

2.2 兩組神經行為學評分比較 創傷組大鼠經打擊后進入無呼吸的意識喪失狀態，15～30 s蘇醒，30～40 s恢復呼吸，5 min內恢復正常呼吸頻率85.5(66～114)次/min。創傷后 2、12、24、48、72 h和7、14 d，創傷組大鼠神經行為學評分分別為(10.04±1.35)、(10.64 ±1.98)、(10.11 ±2.74)、(8.60 ±1.34)、(6.50 ± 2.99)、(9.65 ± 1.98)、(9.88 ±2.30)分，均高于對照組的0分(P均 ＜0.05)。評分從創傷后24 h升高，至48 h最高，7～14 d基本恢復至基線水平(P均＜0.05)。

2.3 兩組腦組織中凋亡神經細胞計數比較 對照組皮層組織可見到少量凋亡神經細胞(1.07±0.78)，創傷組傷后12 h即可見大量凋亡細胞，并逐漸增多，48 h達峰值(P＜0.05)。創傷組創傷后2、12、24、48、72 h 和 7、14 d，凋亡的神經細胞別為(3.36 ± 1.52)、(5.17 ± 1.10)、(13.41 ± 1.92)、(35.43 ± 1.58)、(24.29 ± 2.03)、(17.33 ± 1.47)個/mm2，除傷后2、12 h外，余各時點凋亡神經細胞數均高于對照組(P均＜0.05)。

2.4 創傷組腦組織中miRNA-21表達變化與大鼠神經行為學評分和凋亡神經細胞數量的相關性 創傷組腦組織中miRNA-21表達變化與大鼠神經行為學評分和凋亡神經細胞數變化均呈明顯正相關(r=0.430、0.410，P 均 ＜0.01) 。

3 討論

顱腦創傷過程中的基因表達變化非常復雜，并不是單一信號通路的改變，而是呈現錯綜復雜的立體網絡變化，顱腦創傷瞬間迅速激發了多個基因的表達改變，上游基因表達改變又導致了下游相關基因的表達改變，出現級聯瀑布反應和擴大效應。根據我們前期研究所得結果［5］，可以預見在如此復雜龐大的基因表達網絡中，僅單獨對某個基因實施干預，對腦創傷的治療影響將是有限的，如能夠同時對多基因表達進行干預，將會大大提高治療有效率。

miRNA由21～23個堿基組成的內源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中。哺乳動物的miRNA與靶標mRNA不是序列嚴格互補的完全結合，每一哺乳動物的miRNA都能阻止多個下游靶標mRNA的翻譯，從而封閉多個基因表達。因此，我們推測從干預單個的基因轉向干預miRNA可能會將腦外傷的基因治療達到事半功倍的效果。但目前鮮有見到miRNA在急性腦損傷病理狀態時的研究報道［6］。

有研究［7］發現，miRNA-21在人類多種腫瘤組織中表達上調。我們認為，miRNA-21在腫瘤發生發展中可能起到癌基因的作用，其靶基因很有可能是抑癌基因。有學者認為腫瘤轉移抑制基因TIMP3、凋亡相關基因Bcl-2等可能為miRNA-21的靶基因，這為進一步研究miRNA-21在腦創傷作用機制提供了線索。以miRNA-21可能在促進神經細胞增殖和抑制凋亡方面影響腦創傷患者的預后［8］。

本研究結果表明，創傷后創傷區腦組織中miRNA-21表達明顯上調，且在傷后48 h達峰值，這與創傷后大鼠神經行為學評分變化一致。說明創傷后大鼠腦組織中miRNA-21表達與其平衡能力、生理反射、提尾反射及運動、感覺功能的恢復程度有一定的相關性，上調miRNA-21在腦創傷后腦組織中的表達，有望改善腦創傷預后。

本研究結果還顯示，創傷組凋亡神經細胞數在傷后48～72 h達高峰，而此時點創傷區腦組織中miRNA-21表達明顯上調，兩者呈正相關關系?；趍iRNA-21在膠質瘤中的過表達和miRNA-21抑制細胞程序性凋亡作用的理論基礎［9，10］以及本研究結果顯示，miRNA-21在創傷急性期和修復早期的創傷腦組織中表達上調。我們推測，miRNA-21與創傷后的神經修復和保護密切相關，我們將在腦創傷模型的基礎上給予 miRNA-21干預，以進一步研究miRNA-21與腦創傷預后的關系。

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