高效液相色譜-熒光法測定谷物類農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的多殘留量

周海明

(浙江省嘉興市種植業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 嘉興 314411)

自1985年阿維菌素(abamectin，ABA)是阿維菌素投入農(nóng)藥市場后，通過對母體進(jìn)行半合成化學(xué)結(jié)構(gòu)改造，已開發(fā)了伊維菌素(ivermectin，IVM)、埃瑪菌素(emamectin，EMA)、道拉菌素(dormectin)、埃珀利諾菌素(eprinomectin)和色拉菌素(selamectin)等系列衍生品種，形成一大類阿維菌素類農(nóng)藥［1－2］。該類農(nóng)藥具有殺蟲譜廣、殺蟲活性高、易與多數(shù)農(nóng)藥混配使用等優(yōu)點(diǎn)。阿維菌素類農(nóng)藥在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)已廣泛地應(yīng)用，是我國目前使用范圍最廣的殺蟲劑之一［3］。自2008年我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)阿維菌素和埃瑪菌素在水稻生產(chǎn)上使用，阿維菌素類農(nóng)藥已在水稻、小麥、玉米等大田作物上大量使用。2008年威遠(yuǎn)生化公司的阿維菌素產(chǎn)品-藍(lán)銳在水稻上銷量已突破億元。

目前世界各國農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素類農(nóng)藥的最高殘留限量(MRL值)已有標(biāo)準(zhǔn)限定［4］。由于檢測靈敏度高且不需要昂貴的儀器，液相色譜-熒光法(HPLC-FD)已成為目前最常用的阿維菌素類農(nóng)藥殘留檢測方法［5－7］。在文獻(xiàn)報道中，已有很多關(guān)于畜產(chǎn)品［8］、蔬菜［9］、水［10］等樣品中阿維菌素類農(nóng)(獸)藥殘留分析的論文發(fā)表，但對于谷物類農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素類農(nóng)藥殘留分析的研究還比較少［11］，并且多是單殘留分析。本文通過研究建立了同時檢測谷物類農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的多殘留分析方法，為谷物類農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素類農(nóng)藥殘留分析提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters 2696 Alliance高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters 474掃描熒光檢測器(美國Waters公司)，超純水器(美國 Milli-Q公司)，Kultra turrax高速勻質(zhì)機(jī)(德國 IKA公司)，NEVAPTM111氮吹儀(美國 Organomation Associates Inc公司)，KQ-500B型超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

阿維菌素、埃瑪菌素、伊維菌素、三氟乙酸酐(TFAA)和N-甲基咪唑(NMIM)均為分析純試劑(美國Sigma-Aldrich公司)，乙腈、甲醇、丙酮均為HPLC級產(chǎn)品(德國默克Merck公司)，氯化鈉為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

儲備液:稱取阿維菌素、埃瑪菌素、伊維菌素3種標(biāo)樣各10 mg，用過無水硫酸鈉的乙腈溶解，分別配成質(zhì)量濃度為100 mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)溶液作為儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作系列:分別移取一定體積的阿維菌素、埃瑪菌素、伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用無水乙腈分別配制成 10，50，100，500，1 000，5 000 μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

糙米、小麥和玉米樣品先用粉碎機(jī)粉碎，再過100目(0.149 mm)篩，放在－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱取粉碎樣品20 g放入250 mL平底玻璃瓶中，加入10 mL水和50 mL乙腈。在高速勻質(zhì)器以14 000 r·min－1處理2 min后，提取樣品在超波清洗機(jī)上超聲輔助提取處理15 min，然后在10 000 r·min－1條件下離心5 min，上清液裝入預(yù)裝5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中。具塞量筒劇烈震蕩5 min后靜置30 min，使乙腈相和水相分層。從乙腈相中吸取20 mL提取液轉(zhuǎn)移至25 mL玻璃試管。提取液在氮吹儀上吹干后，試管中加入0.5 mL過無水硫酸鈉的乙腈，在超聲波清洗機(jī)上超聲1 min，使農(nóng)藥殘留完全溶于乙腈。

1.5 柱前衍生化

在避光條件下，分別把0.1 mL N-甲基咪唑和0.2 mL三氟乙酸酐按先后順序加入裝有0.5 mL待衍生化樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液試管中，振蕩搖勻后靜置反應(yīng)30 min。試管中再加入1.2 mL甲醇搖勻，避光反應(yīng)1 h后，過0.45 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行 HPLC-FD測定。

1.6 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);流動相:起始為水-乙腈-甲醇(體積比5∶10∶85)，5 min后為乙腈-甲醇(體積比20∶80)，流速為1.0 mL·min－1。檢測波長:熒光激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長475 nm。柱溫:40℃。進(jìn)樣量:20 μL。定量方法:外標(biāo)法(峰面積)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

阿維菌素類藥物是弱極性化合物，在水中的溶解度低，易溶于乙腈、丙酮、甲醇、乙醇等極性有機(jī)溶劑。以糙米為代表樣品，分別研究不同有機(jī)溶劑(丙酮、乙腈、甲醇和正己烷)對阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的提取效率(表1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用乙腈提取的平均添加回收率最高，變異系數(shù)最小。丙酮提取液雜質(zhì)多，易干擾目標(biāo)物測定，變異系數(shù)較大，其原因可能是丙酮的極性比乙腈強(qiáng)，易把樣品中淀粉、蛋白質(zhì)、糖類化合物等極性雜質(zhì)提取出來，同時由于丙酮在常溫下?lián)]發(fā)性非常強(qiáng)，影響提取液的體積計算，從而造成回收率變異系數(shù)大。正己烷的回收率最低，一方面是正己烷對阿維菌素類農(nóng)藥提取能力不夠，另一方面可能因為正己烷是強(qiáng)非極性溶劑，它無法浸潤進(jìn)入樣品，與樣品接觸不充分。在實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)利用氯化鈉鹽析作用很難使甲醇與水相完全分離，所以甲醇不適用作此方法。

考慮到糙米、小麥和玉米都是干燥樣品，單獨(dú)采用乙腈提取時，溶劑在樣品上無法充分浸潤展開，難以保證溶劑與樣品的充分接觸，所以采用乙腈與水混合作為提取溶劑，以促進(jìn)提取溶劑與樣品的相互接觸。與此同時，采用超聲輔助萃取方法加速樣品中阿維菌素類農(nóng)藥溶于提取溶劑，提高提取效率。

表1 不同提取溶劑對3種阿維菌素類農(nóng)藥的回收率(n=3)

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素是同類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)都非常相近，因此它們在色譜分離上有一定難度，對色譜分離條件要求較高。為了使它們在色譜柱上有適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r間和有效分離，選用了Kromasil C18column(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)、SB-C8column(150 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)、Inertsil ODS-3 column(150 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)等不同類型的反相色譜柱進(jìn)行實(shí)驗。實(shí)驗結(jié)果表明，這3種阿維菌素類農(nóng)藥在C18色譜柱上峰形對稱，重現(xiàn)性好，有合適的保留時間。

在優(yōu)化流動相實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，用乙腈或甲醇與水的固定比例作流動相難以有效分離這3種性質(zhì)相近的農(nóng)藥，同時又要避開雜質(zhì)峰干擾。因此，采用了乙腈-甲醇-水三元梯度洗脫程序?qū)λ鼈冞M(jìn)行色譜分離。通過實(shí)驗優(yōu)化確定了最佳流動相為:起始為水-乙腈-甲醇(體積比 5∶10∶85)，5 min 后為乙腈-甲醇(體積比20∶80)，持續(xù)10 min后結(jié)束檢測;流速一直保持在1.0 mL·min－1;柱溫為40℃。由圖1可見:阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素在小于12 min保留時間內(nèi)都能出峰，獲得了很好的分離效果。

圖1 阿維菌素類農(nóng)藥的標(biāo)樣色譜

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述色譜條件下，分別檢測質(zhì)量濃度為10，50，100，500，1 000，5 000 μg·L－1阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以農(nóng)藥質(zhì)量濃度與峰面積做線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性相關(guān)系數(shù)(表 2)。在 10 ～5 000 μg·L－1范圍內(nèi)農(nóng)藥的峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，它們的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。以4倍信噪比(S/N=4)為計，可分別得出阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的最低檢測限分為 5，10，5 μg·L－1。由此可算出，谷物類農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的最低檢出質(zhì)量濃度分別1，2，1 μg·L－1，低于其MRL值一個數(shù)量級以上。因此，該方法檢測范圍和靈敏度完全能滿足殘留分析要求。

2.4 添加回收實(shí)驗

將阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的混合標(biāo)準(zhǔn)液分別添加到糙米、小麥和玉米樣品中，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，10，100，1 000 mg·kg－14個組，批內(nèi)有3個重復(fù)，共完成3次批間處理。為了保證添加質(zhì)量濃度與樣品混勻，添加農(nóng)藥后樣品避光密封振蕩過夜，采用上述檢測方法進(jìn)行檢測實(shí)驗。研究結(jié)果(圖2－3)表明:經(jīng)過前處理和柱前熒光衍生反應(yīng)后，糙米、小麥和玉米樣品的色譜圖中雜質(zhì)峰非常少，對這3種目標(biāo)物檢測結(jié)果不會產(chǎn)生影響。由表3－5可見:阿維菌素在糙米、小麥和玉米中的添加回收率為85.1%～109.3%，精密度為3.10%～12.44%，準(zhǔn)確度為－14.9% ～9.3%;埃瑪菌素的添加回收率為85.2% ～93.4%，精密度為2.04% ～9.03%，準(zhǔn)確度為－14.8% ～－6.6%;伊維菌素的添加回收率為86.1%～97.3%，精密度為2.98% ～11.07%，準(zhǔn)確度為 －13.3% ～－7.4%。由此可見，研究方法的回收率、精密度和準(zhǔn)確性完全達(dá)到殘留分析要求。

表2 農(nóng)藥的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性相關(guān)系數(shù)

圖2 空白對照糙米樣品的色譜

圖3 添加農(nóng)藥后糙米樣品的色譜

表3 阿維菌素類農(nóng)藥在糙米樣品中的添加回收率、精密度及準(zhǔn)確度(n=3)

表4 阿維菌素類農(nóng)藥在小麥樣品中的添加回收率、精密度及準(zhǔn)確度(n=3)

表5 阿維菌素類農(nóng)藥在玉米樣品中的添加回收率、精密度及準(zhǔn)確度(n=3)

2.5 檢測真實(shí)樣品

采用本文方法對130個市場抽查的糙米樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果(圖4)表明，有1個樣品檢出阿維菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.4 μg·kg－1，檢出率為0.8%，埃瑪菌素和伊維菌素未檢出。

3 小結(jié)

采用HPLC-FD檢測糙米、小麥、玉米等谷物類農(nóng)產(chǎn)品上阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的多殘留分析方法。以乙腈作為提取溶劑能充分提取阿維菌素類農(nóng)藥殘留，同時減少雜質(zhì)提取。流動相采用乙腈/甲醇/水三元梯度洗脫程序后，3種阿維菌素類農(nóng)藥在合適的保留時間內(nèi)能獲得有效分離，同時避開雜質(zhì)干擾。采用高效的熒光衍生化后，該方法具有很高的靈敏度，最低檢出濃度低于MRL值近一個數(shù)量級以上。添加回收實(shí)驗表明本文方法的選擇性高，準(zhǔn)確性和精確性都能達(dá)到農(nóng)藥殘留分析要求，在檢測真實(shí)樣品上得到很好的應(yīng)用。

圖4 抽檢糙米樣品的檢測色譜

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