紅花提取物對腎缺血再灌注損傷的影響

曹譯心 ，張 旭 ，張翠薇 ，何 穎 ，馬躍榮

1.瀘州醫學院組織學與胚胎學教研室，四川瀘州 646000；2.瀘州醫學院病理教研室，四川瀘州 646000；3.瀘州醫學院藥學院中藥學實驗室，四川瀘州 646000

腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是常見的臨床疾病，可導致急性腎功能衰竭。紅花是治療慢性腎臟疾病常用的活血化瘀藥物，有一定的臨床療效，但在IRI方面尚無研究。本研究建立IRI大鼠模型并利用紅花提取物進行干預，旨在觀察紅花提取物是否對IRI具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物為清潔級、健康9周齡SD大鼠，雌雄不拘，體重180～220 g，均由瀘州醫學院動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑

紅花注射液（主要成分：紅花黃色素、紅花醌苷、紅花素、新紅花苷，20 ml/支；十堰麥克制藥有限公司）。大鼠血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）試劑盒（購自上海碧云天生物技術有限公司）、內皮素-1（ET-1）放免試劑盒（購自北京經緯博恒生物科技開發有限公司）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物醫學公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 將40只大鼠隨機分為4組（每組各10只）：缺血再灌注組（陽性對照組）、假手術組（陰性對照組）、紅花低劑量干預組和紅花高劑量干預組。按照文獻[1]的方法處理如下：均以戊巴比妥鈉（5 mg/kg）腹腔麻醉，腹部正中切口，暴露雙側腎，之后各組分別處理如下，①缺血再灌注組，缺血前10 min，腎靜脈給予等容積生理鹽水，夾閉雙側腎動脈，60min后去除動脈夾，同法再給生理鹽水，縫合切口。24 h后各組大鼠以1.5%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉后，腹部正中切開，于下腔靜脈采血；同時取雙腎。②假手術組，不夾閉雙側腎動脈，不給生理鹽水，其余同缺血再灌注組。③紅花低劑量干預組和紅花高劑量干預組分別以10 ml/kg和20 ml/kg的紅花注射液代替生理鹽水，其余同缺血再灌注組。

1.3.2 檢測方法 采集的血液經離心后取血清按試劑盒方法分別測定Scr、BUN和MDA的的含量。取一側腎按其重量加生理鹽水制成10%的組織勻漿，按試劑盒方法測定SOD，同時用放免法測定腎組織ET-1含量。取另一側腎進行石蠟切片行HE染色。

1.3.3 腎臟的病理學觀察 腎組織以中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，行HE染色，用普通光學顯微鏡檢查。觀察腎缺血再灌注后腎小球、腎小管充血、變性、壞死及白細胞浸潤等病理變化。

1.4 統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎功能指標的變化

假手術組Scr及BUN含量均低于其他各組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；缺血再灌注組和紅花低劑量干預組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；但紅花高劑量干預組明顯低于缺血再灌注組和和紅花低劑量干預組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠Scr和BUN的變化（±s）

表1 各組大鼠Scr和BUN的變化（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.01；與缺血再灌注組和紅花低劑量干預組比較，bP＜0.05

組別 例數10101010假手術組缺血再灌注組紅花低劑量干預組紅花高劑量干預組Scr（μmol/L）85.59±11.37722.44±77.02a 673.06±102.59a 485.57±77.90ab BUN（mmol/L）6.74±1.0249.54±3.39a 45.11±6.74a 34.05±4.04ab

2.2 ET-1、SOD和MDA檢測

ET-1的含量水平，假手術組均低于其他各組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；缺血再灌注組和紅花低劑量干預組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；紅花高劑量干預組明顯低于缺血再灌注組和和紅花低劑量干預組 （P＜0.05）。SOD的含量水平，假手術組均高于其他各組（P＜0.01）；紅花低劑量干預組和紅花高劑量干預組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但二者都同時高于缺血再灌注組（P＜0.05）。MDA的含量水平，假手術組均低于其他各組（P＜0.01）；紅花低劑量干預組和紅花高劑量干預組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但二者都同時低于缺血再灌注組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠ET-1、SOD和血MDA的變化（±s）

表2 各組大鼠ET-1、SOD和血MDA的變化（±s）

注：與假手術組比較，aP＜0.01；與缺血再灌注組和紅花低劑量干預組比較，bP＜0.05；與缺血再灌注組比較，cP＜0.05

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2.3 病理組織學改變

除假手術組外，各組均出現不同程度的腎小球毛細血管擴張充血，腎小球囊腔擴張，腎小管上皮細胞空泡樣變性，近曲小管管壁腫脹，管腔變小及少量炎癥細胞浸潤。其中，以缺血再灌注組最重，甚至還出現腎小管上皮細胞顆粒樣變以及明顯的腎小管壞死、管腔堵塞和刷狀緣脫落。此外，腎小管腔可見炎癥細胞和蛋白管型，而紅花高劑量干預組最輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學改變（HE染色，×400）

3 討論

IRI屬急性腎損傷的范疇，在臨床上十分常見，但目前尚無有效的防治方法。IRI所致的急性腎功能衰竭在臨床較為常見，IRI系氧自由基引起的微循環血流障礙以及由細胞因子介導的對內皮細胞及實質細胞的免疫損傷。缺血期間，首先造成器官的ATP儲備衰竭，繼而通過無氧代謝提供能量，表現為糖酵解增加。灌注早期，大量注入的血氧一時不能充分利用，作為各種氧化酶的底物而產生氧自由基。再灌注時往往存在紅細胞外滲，同時紅細胞又易受到氧自由基的攻擊，出現形態改變和聚積，導致血液黏度增加，紅細胞溶解，進而產生大量血紅蛋白。血紅蛋白通過損傷脂質雙分子層、細胞骨架、細胞代謝酶及DNA，并促進氧自由基產生，從而加重內皮細胞損傷[2]。本研究結果顯示缺血再灌注后大鼠的Scr和BUN顯著上升，說明其腎功能顯著減退，表明IRI對腎功能影響顯著。

紅花屬菊科植物，其主要活性成分有紅花黃素、脂肪酸、黃酮醇類、紅花多糖、鏈烷雙醇、豆甾醇和紅花胺等。紅花有活血通經、去瘀止痛的功能[3]。紅花提取物能抑制血小板聚集，降低血液黏度，其有效成分紅花黃色素能延長凝血酶原時間和凝血酶時間[4]。

SOD是廣泛存在于需氧物體內的一種金屬酶，能催化超氧陰離子自由基產生歧化反應，是體內最為重要的自由基清除劑。可以歧化O2生成H2O2，從而保護細胞不受毒性氧自由基損傷[5]。MDA是機體內氧自由基代謝中產生的脂質過氧化產物，它可以反映該體系中脂質過氧化自由基的存在及反應的程度，引發細胞膜大分子物質（如蛋白、脂質等）相互交聯、聚合，從而加重細胞膜變性和功能障礙[6]。

本實驗結果顯示相對假手術組，缺血再灌注組SOD含量顯著減少，MDA含量顯著升高，BUN、Scr明顯增加。表明缺血再灌注后，腎組織因為SOD的顯著減少，清除氧自由基的能力降低，導致腎結構被破壞，同時功能下降。同時本實驗應用紅花提取物干預缺血再灌注損傷過程，發現相對沒有使用紅花提取物干預的組分，干預組SOD含量較高，MDA含量明顯較低，而對應的BUN、Scr明顯較低，說明紅花提取物可能能在一定程度上維持缺血性腎臟組織中的SOD活性，進而可以保持較高的氧自由基清除能力而起到保護腎臟的作用。

綜上所述，本研究發現紅花提取物可以減輕IRI的程度，可改善相應的腎功能。但其具體機制有待進一步研究。

[1]謝智慧,曹瑞,陳宗,等.高壓氧干預對大鼠腎缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究[J].中華物理醫學與康復雜志,2010,32(2):98-101.

[2]梁鋼,黃巨恩,張肅,等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對腎缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國藥理學通報,2003,19(1):97-100.

[3]郭曉鳳.中藥紅花的研究進展[J].中國民族民間醫藥,2008,17(2):73-74.

[4]賈菲菲,柴秋彥,賈俊.紅花黃色素B抗凝作用研究[J].山西中醫學院學報,2009,10(3):13-15.

[5]楊佳丹,董志,歐陽凈.兩維來司鈉對實驗性大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].重慶醫科大學學報,2007,32(6):578-580.

[6]Patel NS,Sharples EJ,Cuzzocrea S,et al.Pretreatment with EPO reduces the injury and dysfunction caused by ischemia/reperfusion in the mouse kidney in vivo[J].Kidney Int,2004,66(3):983-989.