高效液相色譜法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法測(cè)定茶堿的血藥濃度

范 毅，劉 夢(mèng)

(1.江蘇省泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300; 2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226000)

茶堿是黃嘌呤類(lèi)抗支氣管痙攣藥，具有良好的平喘、抗炎作用，幾十年來(lái)一直是治療支氣管哮喘等急、慢性肺部疾病的常用藥物，但其治療劑量與中毒劑量較接近，安全范圍較窄，劑量過(guò)大或給藥速度太快，易引起嚴(yán)重毒性反應(yīng)甚至死亡，因此檢測(cè)茶堿的血藥濃度非常重要。其檢測(cè)方法很多，常用的有高效液相色譜法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法，兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)[1－7]。筆者采用兩種方法對(duì)茶堿進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，并求出二者的相關(guān)性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)，包括2487型雙通道紫外檢測(cè)器、1525型二元泵、Empower色譜工作站、80－2型離心機(jī)。茶堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為10121－9903);甲醇(TEDIA，色譜純);空白血漿(泰州市中心血站提供)。AXSYM化學(xué)發(fā)光酶免疫分析儀(美國(guó)雅培公司);茶堿試劑盒(TheophllineⅡReagent Pack，美國(guó)雅培公司，批號(hào)為75267q101)。

1.2 病例資料

2010年3月至2010年5月在我院病房使用氨茶堿治療的患者共40例。其中男29例，女11例;平均年齡69歲。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

精密稱(chēng)取茶堿對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，用甲醇－水(5∶5)溶解，稀釋至刻度，即得10 g/L的茶堿對(duì)照品貯備液，置4℃冰箱冷藏備用。取乙丙醇5 mL加入95 mL三氯甲烷中，混勻，即得三氯甲烷－乙丙醇(95∶5)提取液。

2.2 樣品采集與處理

選擇使用茶堿的患者，前臂靜脈取血，達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度(5～7個(gè)半衰期)后，下一次用藥前空腹采血3 mL，2500 r/min離心 5 min，取血清置4℃冷藏，備用。取血清樣品300 μL，置15 mL離心管中，加入提取液3.4 mL，渦旋振蕩2 min，3500 r/min離心10 min，取下清液 0.3 mL，置另 1 只 1.5 mL 離心管中，40 ℃ 吹干，用流動(dòng)相 100 μL 溶解，渦旋，取 10 μL 進(jìn)樣。

2.3 高效液相色譜法

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:大連依利特Hypersil BDS C18柱(105 mm×4.6mm，5.0μm);柱溫:25℃;流動(dòng)相:甲醇－水(5∶5);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):273 nm;保留時(shí)間:2.8 min;進(jìn)樣量:10 μL。茶堿的保留時(shí)間為 2.8 min，峰形良好，血漿對(duì)茶堿的測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.2 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密稱(chēng)取茶堿對(duì)照品貯備液適量，加空白血漿分別稀釋成5，10，20，40，60，80μg/mL 的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液。取茶堿系列質(zhì)量濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)液，按2.2項(xiàng)下方法處理后，取10 μL進(jìn)樣，以峰面積(A)對(duì)藥物質(zhì)量濃度(C)作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=16688 C－14173，r=0.9998(n=5)。結(jié)果表明，茶堿質(zhì)量濃度在 5.0 ～80.0μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取空白血漿加入茶堿對(duì)照品，配制成10，20，40μg/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2項(xiàng)下方法處理血漿樣品后，取10 μL進(jìn)樣，1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算低、中、高3種質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法色譜圖

表1 回收率與精密度測(cè)定結(jié)果(n=5)

回收率試驗(yàn):取配制質(zhì)量濃度為10，20，40μg/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2項(xiàng)下方法處理后，取10 μL進(jìn)樣，將標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的各質(zhì)量濃度與實(shí)際質(zhì)量濃度比較。結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，平均回收率為102.77%，RSD=2.066%。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取低、中、高 3 種質(zhì)量濃度(10，20，40μg/mL)的茶堿血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液各兩份，每份各3 mL，1份室溫放置，1份于－20℃冷凍放置，分別于 0，2，4，8，12 h 時(shí)取樣，按 2.2 項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，茶堿血漿樣品在室溫和反復(fù)凍融條件下均穩(wěn)定，測(cè)定時(shí)不需特殊保護(hù)處理。

2.4 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法

測(cè)定原理:采用微粒子固相免疫競(jìng)爭(zhēng)法，借助化學(xué)發(fā)光基質(zhì)產(chǎn)生光子，根據(jù)化學(xué)發(fā)光體系中光子發(fā)光強(qiáng)度的大小，測(cè)定微量的抗原或抗體。AXSYM分析儀在檢測(cè)過(guò)程中采用全自動(dòng)精確加樣系統(tǒng)、恒溫系統(tǒng)、試劑冷藏系統(tǒng)、超聲波清洗系統(tǒng)、磁場(chǎng)分離系統(tǒng)和中心數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等，能減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高檢測(cè)速度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取質(zhì)量濃度為 0，2.5，5，10，20，40μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，加入專(zhuān)用的制備免疫分析儀標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品杯中，放入茶堿試劑盒，運(yùn)行后儀器自動(dòng)進(jìn)行測(cè)試和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。回歸方程為A=－2.7545 C+169.03，r=0.9987(n=6)。

回收率試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為5，10，20μg/mL的茶堿標(biāo)準(zhǔn)液，吸取10 μL加入樣品杯中，放入茶堿試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每份樣品測(cè)定3次，考察方法回收率。由表1結(jié)果可見(jiàn)，平均回收率為101.17%，RSD=1.16% 。

2.5 兩種方法測(cè)定結(jié)果比較

取患者的血樣40例，同一份血樣分別使用高效液相色譜法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法測(cè)定血藥濃度，所得結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性濃度分析，以高效液相色譜法測(cè)得的質(zhì)量濃度為 X、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法測(cè)得的質(zhì)量濃度為Y，得回歸方程 Y=0.9577X+0.4938，r=0.9765。結(jié)果表明，兩種方法測(cè)得的結(jié)果無(wú)顯著性差異，見(jiàn)圖2。

圖2 兩種方法相關(guān)性

3 討論

本試驗(yàn)中兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。高效液相色譜法準(zhǔn)確、靈敏度高，色譜峰分離比較完全，峰形與重現(xiàn)性都比較好，但耗時(shí)較長(zhǎng)，適用于要求較高的藥代動(dòng)力學(xué)研究。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法需要專(zhuān)門(mén)的試劑盒，比較昂貴，但可同時(shí)大量地對(duì)同種藥物的血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，節(jié)約時(shí)間，提高工作效率。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法無(wú)顯著性差異，相關(guān)系數(shù) r=0.9765，表明這兩種方法有較好的相關(guān)性，測(cè)定結(jié)果無(wú)需互相校正。

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