高效液相色譜法同時測定止痢寧片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量

張火旺

(廣東省河源市藥品檢驗所，廣東 河源 517000)

止痢寧片由穿心蓮、苦木、木香3味中藥組成，具有清熱祛濕、行氣止痛之功效，用于腸炎、痢疾等癥。現行標準[1]中，只有定性方法，無含量測定方法。已有文獻報道對止痢寧片中的穿心蓮內酯[2]、脫水穿心蓮內酯[3]分別進行了質量控制，但僅控制1種成分不能較全面地反映產品的質量。為更好地控制該藥品質量，保證臨床用藥的安全、有效，筆者采用高效液相色譜法同時測定止痢寧片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量，作為該產品質量控制指標之一，現報道如下。

1 儀器與試藥

安捷倫1200型自動高效液相色譜儀，日本島津UV－2450型紫外分光光度計，CP225D型電子天平，SB2200型超聲處理器。甲醇(色譜純，TEDIA);水為超純水;穿心蓮內酯對照品(批號為110797－200307)、脫水穿心蓮內酯對照品(批號為 110854－200306，供含量測定用)均購自中國藥品生物制品檢定所，含量均為 100%;止痢寧片(市售品，批號分別為 101006，090601，090703，090901)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－水(50∶50);穿心蓮內酯檢測波長∶225 nm;脫水穿心蓮內酯檢測波長∶250 nm;流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μL。以峰面積外標法定量[4]。

2.2 溶液制備

精密稱取10.25 mg經五氧化二磷干燥24 h的穿心蓮內酯對照品，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作為穿心蓮內酯對照品貯備液;精密稱取經五氧化二磷干燥24 h的脫水對照品10.10 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作為脫水穿心蓮對照品貯備液;兩種對照品貯備液均用0.45 μm濾膜濾過，即得對照品溶液。取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(過三號篩)，精密稱取適量(約相當于2片的質量)，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，密塞，置超聲儀超聲30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按其質量標準中處方比例同法制備不含穿心蓮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

干擾試驗:分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，按上述色譜條件進樣測繪高效液相色譜圖，結果兩組分的出峰時間區域沒有干擾峰，表明處方中其他成分和輔料對樣品的測定無干擾作用(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:精密量取穿心蓮內酯對照品貯備液和脫水穿心蓮內酯對照品貯備液各 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置50 mL和25 mL量瓶中，加甲醇至刻度并搖勻，分別配成穿心蓮內酯對照品溶液和脫水穿心蓮內酯對照品溶液，按上述色譜條件分別進樣10 μL，測定峰面積。以峰面積積分值(A)為縱坐標、穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯對照品溶液質量濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程穿心蓮內酯為 A=25.555C+0.6413(r=1.0000)，脫水穿心蓮內酯 A=20.234C－12.099(r=0.9998)。結果表明，穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯的進樣量分別在0.0205～0.1230μg和0.0808～0.4848μg范圍內與相應的峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取同一對照品溶液，連續重復進樣6次。結果峰面積的 RSD分別為1.7%和0.48%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取同一批樣品，精密稱取6份，按樣品測定方法平行測定兩組分的含量。結果穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯的RSD分別為0.73%和0.70%(n=6)，表明方法重復性好。

穩定性試驗:取同一批供試品溶液，在室溫放置，每隔2 h測定1次，連續測定7次。結果穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯含量的RSD分別為0.82%和0.53%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗:精密稱取穿心蓮內酯對照品10.20 mg，置50 mL量瓶中，精密吸取5 mL，置20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為穿心蓮內酯對照品溶液(含穿心蓮內酯0.0510 g/L);精密稱取已知含量的樣品(批號為101006，穿心蓮內酯含量0.6250 mg/g，平均片重0.3500 g/片)適量，共6份，分別加入上述對照品溶液2，4，5 mL，按供試品溶液制備的方法操作，進樣測定含量，計算回收率。結果見表1。另取2.2項下的脫水穿心蓮內酯對照品溶液(含脫水穿心蓮內酯0.2020 g/L)，作為脫水穿心蓮內酯對照品溶液;精密稱取已知含量的樣品(批號為101006，脫水穿心蓮內酯含量 1.1220 mg/g，平均片重 0.3500 g/片)適量，共 6 份，分別加入上述對照品溶液1，2，3 mL，按供試品溶液制備的方法操作，進樣測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取4批樣品，按擬訂的方法制備供試品溶液，進樣 10 μL，記錄峰面積，按外標法計算含量，結果見表2。根據 4批樣品所測結果，暫定止痢寧片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯總量定量限為1.0 mg/g。

3 討論

在選擇檢測波長時，取穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯對照品適量，用甲醇為溶劑，經紫外－可見分光光度計掃描，穿心蓮內酯在225 nm波長下有最大吸收，而脫水穿心蓮內酯在250 nm波長有最大吸收，靈敏度高，故選225 nm作為穿心蓮內酯檢測波長，250 nm作為脫水穿心蓮內酯檢測波長。

分別超聲處理樣品 10，20，30，40，60 min，測得穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量最高的系超聲處理30 min，故認為超聲處理30 min基本提取完全，最終選用甲醇超聲處理30 min。

曾以甲醇－水溶液(55∶45)為流動相，但樣品的分離度不好，主峰形不好;用甲醇－水溶液(40∶60)為流動相時，主峰分離好，但保留時間太長，不適合作研究;而用甲醇－水溶液(50∶50)為流動相時主峰形較對稱，分離效果較好。

表2 4批樣品含量測定結果(mg/g，n=3)

4批樣品中，不同廠家生產的批次含量相差較大，但部頒藥品標準沒有含量測定標準。方法學考察結果表明，所建立的方法回收率、精密度、重現性好，這樣就能更好、更進一步完善止痢寧的質量標準指標。

本方法同時測定穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量，操作簡便、快捷，精密度和準確度都較好。原標準無含量測定，本方法的建立，有利于更好地提高和控制藥品質量。

[1]WS3－B－0703－91，中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第 4 冊)[S].

[2]王先友，袁 琦.HPLC色譜法測定止痢寧片中穿心蓮內酯含量[J].河南大學學報(醫學版)，2009，28(1):11－12.

[3]單 敏，劉海靜，喬蓉霞.HPLC色譜法測定止痢寧片中脫水穿心蓮內酯的含量[J].陜西中醫，2004，25(6):553－554.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄29.